發(fā)布時間：2017-09-16 19:17

  本文關(guān)鍵詞：侵入細(xì)胞內(nèi)的牙齦卟啉單胞菌影響人牙周膜細(xì)胞增殖和成骨向分化的實驗研究

  更多相關(guān)文章： 人牙周膜細(xì)胞 牙齦卟啉單胞菌 侵襲效能 增殖性能 成骨向分化

【摘要】：研究背景及目的牙周病是造成成人牙齒缺失的第一大疾病。大量的實驗研究、流行病學(xué)資料和臨床觀察證明,牙周病是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引發(fā)牙周病的始動因子,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)就是最為常見的,且目前公認(rèn)的牙周致病菌之一。研究表明,P. gingivalis可以附著在頰粘膜、牙周袋上皮細(xì)胞以及通過細(xì)菌的共聚作用附著于菌斑中其他細(xì)菌的表面,如伴放線放線桿菌、具核梭桿菌等；可以產(chǎn)生牙齦素、膠原酶、脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)等毒力因子,并對牙周組織產(chǎn)生破壞作用,使附著喪失、牙槽骨吸收增加,進(jìn)而造成牙齒松動脫落；此外P. gingivalis還可以侵入到宿主細(xì)胞內(nèi),使得其自身可以逃避宿主的先天性免疫防御。侵入宿主細(xì)胞內(nèi)的P. gingivalis不但可以在細(xì)胞內(nèi)長期生存,還能通過細(xì)胞間橋擴散感染臨近細(xì)胞。目前關(guān)于牙齦卟啉單胞菌對牙周病發(fā)生發(fā)展的作用機制尚未完全闡明。以往的實驗研究主要針對牙齦卟啉單胞菌的某一毒力因子對牙周組織或細(xì)胞的作用來研究其致病機制,但由于寄居在宿主體內(nèi)的細(xì)菌多是以活體狀態(tài)存在,而細(xì)菌的某些毒力因子,如LPS只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞細(xì)胞后才釋放出來,因此對于細(xì)菌單一組分在疾病中作用的研究并不能反應(yīng)疾病的真實狀態(tài),而且也有相關(guān)研究表明,活體P.gingivalis與其毒力因子組分在宿主細(xì)胞中所引發(fā)的反應(yīng)并不完全一致。本研究通過探討寄居在人牙周膜細(xì)胞內(nèi)的活體P. gingivalis對人牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)、增殖、成骨向分化等生物學(xué)性能的影響,為牙周病發(fā)病機制的研究提供相關(guān)實驗依據(jù)。研究內(nèi)容第一章人牙周膜細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定目的：體外分離培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞(Human periodontal ligament cells, hPDLCs),觀察人牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特點,對其來源進(jìn)行鑒定,為下一步實驗提供基礎(chǔ)。方法：1.取12～25歲正畸患者因治療需要減數(shù)拔除的,牙周及牙體均健康的前磨牙,無菌條件下刮取根中三分之一牙周膜組織,改良組織塊酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)并傳代。取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞,倒置相差顯微鏡觀察其生長形態(tài)及特征。2.取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞,通過免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白染色,鑒定人牙周膜細(xì)胞來源。3.取對數(shù)生長期的第3代hPDLCs, MTT (5-diphenyl tetrazolium bromide,四甲基偶氮唑鹽)法連續(xù)檢測hPDLCs七天的細(xì)胞增殖活性,繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果：1.原代培養(yǎng)5-10天左右可見有成纖維細(xì)胞從組織塊周邊游出,高倍鏡下觀察可見細(xì)胞呈長梭形或星形,胞體豐滿,胞質(zhì)均勻,中央有圓形或卵圓形的胞核,核仁清晰可見,為成纖維樣細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞24h內(nèi)可貼壁,貼壁后增殖速度快,漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形,呈放射狀排列。2.免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示：波形絲蛋白染色呈陽性,角蛋白染色呈陰性,表明培養(yǎng)的細(xì)胞來源于間葉組織。3. hPDLCs接種1～2天時細(xì)胞增長緩慢,3天后增殖迅速,7天左右到達(dá)平臺期,符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長規(guī)律,其生長曲線呈倒“S”型,說明細(xì)胞增殖能力良好。結(jié)論：改良組織塊酶消化法成功分離培養(yǎng)hPDLCs,所獲得的細(xì)胞呈纖維樣,且保持了間充質(zhì)來源細(xì)胞群的特性,增殖能力良好,可滿足后續(xù)實驗需要。第二章牙齦卟啉單胞菌的體外培養(yǎng)和鑒定目的：體外培養(yǎng)人牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis),觀察其體外培養(yǎng)的形態(tài)特點,對其進(jìn)行菌種鑒定,供后續(xù)實驗使用。方法：將凍存的P. gingivalis菌株ATCC33277復(fù)蘇后接種于BHI羊血瓊脂培養(yǎng)基(含50mL/L凍溶羊血、5mg/L氯化血紅素和1mg/L維生素K3),37℃厭氧培養(yǎng)(80%N2、10%CO、10%H2),觀察菌落的生長形態(tài),并進(jìn)行革蘭氏染色。細(xì)菌培養(yǎng)7d后,用無菌槍頭挑取一個單菌落至2mL BHI液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)約24h,取1mL混濁的菌液送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行16s rDNA菌種測序鑒定。結(jié)果：1.牙齦卟啉單胞菌固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后,培養(yǎng)皿上有菌落形成,菌落為白色,直徑約0.5-1mm,突起于培養(yǎng)基表面,質(zhì)硬,與培養(yǎng)基表面黏附較緊；培養(yǎng)7d后,菌落由白色變成黑色。革蘭氏染色結(jié)果顯示,牙齦卟啉單胞菌呈紅色球桿狀,為革蘭氏陰性菌。2.16s rDNA測序結(jié)果證明所挑選細(xì)菌為P. gingivalis ATCC33277。結(jié)論：采用厭氧培養(yǎng)法成功培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌,并證實其為P. gingivalis標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277。第三章牙齦卟啉單胞菌對人牙周膜細(xì)胞侵襲效能的比較研究目的：比較不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)和侵襲時間下,活體P. gingivalis對hPDLCs的侵襲效能,構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌活菌胞內(nèi)感染人牙周膜細(xì)胞的體外模型,為下一步實驗提供基礎(chǔ)。方法：1.將hPDLCs和P. gingivalis分別以MOI為10和100共培養(yǎng)90min、8h、24h后,利用細(xì)胞侵襲實驗和流式細(xì)胞儀分析比較不同時間及MOI值下,P. gingivalis對hPDLCs的侵襲效能。2.將hPDLCs和熒光標(biāo)記過的P. gingivalis以MOI為10共培養(yǎng)24小時后,使用Alexa Fluor(?)594 Phalloidin標(biāo)記細(xì)胞骨架中的F-actin, DAPI復(fù)染細(xì)胞核,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察P. gingivalis侵入細(xì)胞的情況。結(jié)果：1. hPDLCs和P. gingivalis共培養(yǎng)90min后,P. gingivalis即可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),共培養(yǎng)24h后,侵襲效能達(dá)到最大值。2.MOI=10或100時,肉眼可見培養(yǎng)皿上P. gingivalis菌落數(shù)無明顯差別,提示MOI為10或100時,P. gingivalis對hPDLCs的侵襲效能并無明顯差別。3.激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：被熒光染料SYTO-9標(biāo)記的呈現(xiàn)綠色熒光的P. gingivalis位于hPDLCs的胞漿內(nèi),且主要分布在核周,且?guī)缀跛械募?xì)胞內(nèi)都可觀察到綠色熒光。結(jié)論：成功建立了P. gingivalis侵襲hPDLCs的體外模型。侵襲效能最大的時間為24h,當(dāng)MOI為10或100時,牙齦卟啉單胞菌侵襲效能并無明顯差異。第四章牙齦卟啉單胞菌對人牙周膜細(xì)胞增殖和成骨向分化的影響目的：探究侵入hPDLCs的活體P. gingivalis對細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)、增殖性能及成骨向分化的影響。方法：1.透射電子顯微鏡觀察P. gingivalis對hPDLCs生物學(xué)形態(tài)的影響。2. CFDA-SE標(biāo)記hPDLCs,加入P. gingivalis后分別共培養(yǎng)8h、24h、48h、 72h,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖性能的變化。3.流式細(xì)胞儀檢測P. gingivalis對hPDLCs凋亡的影響。4.將SYTO-9標(biāo)記的P. gingivalis與hPDLCs共培養(yǎng)24h后,熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)分選出被P. gingivalis感染細(xì)胞,對分選出的細(xì)胞hPDLCs進(jìn)行礦化誘導(dǎo),正常的hPDLCs作為對照,分別于7d、14d、21d進(jìn)行茜素紅染色檢測hPDLCs礦化結(jié)節(jié)形成。5.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Quantitative Real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)和免疫印跡技術(shù)(Western Blot, WB)檢測hPDLCs中礦化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2, Runx2)在nRNA和蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果：1.透射電鏡觀察結(jié)果顯示：侵入hPDLCs的P. gingivalis能夠在細(xì)胞內(nèi)存活,但未改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：P. gingivalis分別感染hPDLCs 8h、24h、48h、72h后,細(xì)胞除少量自增殖外,沒有發(fā)生明顯的增殖改變。3.細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI流式檢測顯示：P. gingivalis感染hPDLCs后,出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)無明顯變化。4.礦化誘導(dǎo)實驗結(jié)果顯示：P. gingivalis感染hPDLCs后,細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成明顯減少。5. qRT-PCR實時熒光定量PCR和Western Blot結(jié)果顯示：P. gingivalis感染hPDLCs后,細(xì)胞Runx2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論：侵襲進(jìn)入hPDLCs內(nèi)的活體P. gingivalis可在細(xì)胞內(nèi)存活,且未對細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)、細(xì)胞凋亡、增殖能力產(chǎn)生明顯的影響,但可以明顯抑制hPDLCs的成骨向分化,這可能是通過下調(diào)Runx2的表達(dá)來實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：人牙周膜細(xì)胞 牙齦卟啉單胞菌 侵襲效能 增殖性能 成骨向分化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-19
• 第一章 人牙周膜細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定19-30
• 1 材料與方法19-25
• 2 結(jié)果25-27
• 3 討論27-30
• 第二章 牙齦卟啉單胞菌的體外培養(yǎng)和鑒定30-35
• 1 材料與方法30-32
• 2 結(jié)果32-33
• 3 討論33-35
• 第三章 牙齦卟啉單胞菌對人牙周膜細(xì)胞侵襲效能的比較研究35-47
• 1 材料與方法35-39
• 2 結(jié)果39-44
• 3 討論44-47
• 第四章 牙齦卟啉單胞菌對人牙周膜細(xì)胞增殖和成骨向分化的影響47-68
• 1 材料與方法47-59
• 2 結(jié)果59-66
• 3 討論66-68
• 全文總結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 中英文對照縮略詞表77-78
• 成果78-80
• 致謝80-81

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本文編號：864937