本文關(guān)鍵詞：IL-24聯(lián)合自噬抑制劑影響口腔鱗癌生長作用的研究

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【摘要】：口腔鱗狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一,惡性程度較高,具有容易向周圍神經(jīng)、腺體、肌肉及骨組織廣泛浸潤的特點,且易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的治療手段主要包括手術(shù)治療、放射治療及化學藥物治療等。手術(shù)治療在切除腫瘤的同時,往往會造成大面積的顏面部組織缺損,給患者的身心帶來極大的創(chuàng)傷。而放療與化療在殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也會造成損傷,并且易引發(fā)免疫功能下降、骨髓抑制、肝腎損害、甚至死亡等嚴重并發(fā)癥。因此,尋求一種新的、有效的治療方法是目前治療口腔鱗狀細胞癌的研究熱點。伴隨著細胞和分子生物學技術(shù)的發(fā)展,基因療法為腫瘤治療提供了新的思路。白細胞介素24(Interleukin-24,IL-24)是一種新型的具有腫瘤特異性的細胞凋亡誘導因子,其不僅可抑制腫瘤細胞的生長,誘導其凋亡,還可提高腫瘤細胞對放化療的敏感性、抑制腫瘤內(nèi)血管生成及誘導宿主發(fā)生抗腫瘤相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng),而對正常細胞并沒有明顯的損傷作用。但是也發(fā)現(xiàn),與腫瘤放化療類似,腫瘤細胞對IL-24時常會產(chǎn)生治療抗性,腫瘤細胞產(chǎn)生的治療抗性是臨床非手術(shù)治療失敗導致腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一。近年研究顯示,細胞自噬(Autophagy)可以將腫瘤細胞受損的細胞器及一些大分子物質(zhì)運送至溶酶體中降解,從而為腫瘤細胞的存活提供一種自我保護機制,由此為腫瘤細胞逃避放療及化療引起的損傷而繼續(xù)存活提供了保障。因此,細胞自噬作為腫瘤細胞的耐藥機制之一被人們所廣泛關(guān)注,并試圖通過控制細胞自噬實現(xiàn)臨床腫瘤治療的有效性。雖然IL-24對多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出較強的抑制作用,但是對口腔鱗狀細胞癌而言IL-24是否同樣可以抑制其生長以及在給藥過程中可否誘發(fā)耐藥均無相關(guān)文獻報道。本文為探討口腔鱗狀細胞癌的IL-24生物治療可行性,從IL-24的有效濃度、細胞內(nèi)表達特征、抑制生長的作用機制做了系統(tǒng)的分析,并進一步深入研究了IL-24作用口腔鱗狀細胞癌細胞及腫瘤組織后對細胞自噬的誘導情況,同時探討了IL-24聯(lián)合細胞自噬抑制劑3-MA用于抑制口腔鱗狀細胞癌增殖和生長的有效性。在研究中,首先在確定新型雜合病毒載體Ad LTR2EF1α以及重組了IL-24基因的Ad LTR2EF1α-IL-24重組體感染細胞的有效濃度的基礎(chǔ)上,分析IL-24重組體表達能力及重組蛋白的類型,證實該重組體可有效表達細胞內(nèi)儲留型及分泌型兩種類型的IL-24蛋白。進而,將Ad LTR2EF1α-IL-24感染人口腔鱗狀細胞癌細胞系KB細胞,以探討IL-24對口腔鱗癌細胞的生長抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ad LTR2EF1α-IL-24可以有效的抑制KB細胞增殖和小鼠KB細胞移植瘤的生長,而作為正常細胞對照的人永生化上皮細胞Ha Ca T細胞及移植瘤鼠的肝臟,心臟,肺臟等正常器官而言均無明顯的損傷作用。此結(jié)果表明,IL-24可以有效的抑制口腔鱗癌細胞的增殖及生長而對正常細胞無明顯毒副作用。為了探討IL-24抑制口腔鱗癌細胞增殖和腫瘤生長的機制,研究檢測了口腔鱗癌細胞系KB體外感染IL-24重組體和KB細胞荷瘤鼠瘤周注射IL-24后腫瘤細胞的增殖活性、細胞周期變化、凋亡狀態(tài)、凋亡相關(guān)蛋白表達量及表達活性的變化。結(jié)果表明,IL-24可以增強口腔鱗癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達量及表達活性,從而增強口腔鱗癌細胞的凋亡,進而抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖及生長。在研究以上細胞生物學作用的同時,本研究深入分析了IL-24感染KB細胞后,KB細胞的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用IL-24感染的KB細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的具有雙層膜的囊泡狀結(jié)構(gòu)。進一步采用透射電鏡觀察、GFP-LC3轉(zhuǎn)染、MDC染色和western blot檢測自噬相關(guān)蛋白等方法,證實這些具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡即為自噬體。由此表明,IL-24在誘導KB細胞凋亡抑制其增殖和瘤體生長的同時,也具有誘導KB細胞的細胞自噬作用。由此提示KB細胞可以通過保護性自噬作用對IL-24產(chǎn)生抵抗,從而影響IL-24對KB細胞及其腫瘤組織的有效殺傷作用。為了解決IL-24重組蛋白在抑制口腔鱗狀細胞癌增殖生長的同時伴發(fā)的保護性細胞自噬問題,本文在研究中探討了IL-24聯(lián)合細胞自噬抑制劑3-MA用于抑制口腔鱗狀細胞癌增殖和生長的有效性,以期通過抑制自噬進一步提高IL-24抑制腫瘤的作用。實驗應(yīng)用經(jīng)典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)聯(lián)合IL-24處理口腔鱗狀細胞癌KB細胞,分析了聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑后KB細胞的增殖活性、細胞周期阻滯效果和移植瘤生長能力。結(jié)果表明,自噬抑制劑可以有效的增加IL-24誘導的細胞凋亡,增強IL-24對口腔鱗狀癌細胞的生長抑制作用。綜上所述,本研究通過不同方法從不同角度闡述了IL-24對口腔鱗狀細胞癌的生長抑制作用,并證明促進口腔鱗狀細胞癌的凋亡是IL-24抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤生長的主要機制。同時,本研究還發(fā)現(xiàn)IL-24可以誘發(fā)口腔鱗狀細胞癌的自噬活性,深入探討了抑制口腔鱗狀細胞癌的保護性自噬可以提高IL-24對口腔鱗狀細胞癌的生長抑制作用。這些結(jié)果將為IL-24及自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于治療口腔鱗狀細胞癌的臨床研究提供可靠的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：口腔鱗狀細胞癌 IL-24 細胞凋亡 細胞自噬 基因治療
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.85
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 第1章 緒論15-36
• 1.1 課題背景及研究的目的和意義15-16
• 1.2 口腔鱗狀細胞癌16-26
• 1.2.1 口腔鱗狀細胞癌的易感因素16-18
• 1.2.2 口腔鱗狀細胞癌的分子生物學研究進展18-24
• 1.2.3 口腔鱗狀細胞癌的臨床治療24-26
• 1.3 IL-24與腫瘤的基因治療26-30
• 1.3.1 IL-24的結(jié)構(gòu)27
• 1.3.2 IL-24在人體中的表達27-28
• 1.3.3 IL-24的受體28
• 1.3.4 IL-24的抗腫瘤作用28-30
• 1.4 細胞自噬30-33
• 1.4.1 自噬與腫瘤30
• 1.4.2 自噬與腫瘤細胞的耐藥30-32
• 1.4.3 自噬與腫瘤細胞凋亡32-33
• 1.5 本文的主要研究內(nèi)容和技術(shù)路線33-36
• 1.5.1 本文的主要研究內(nèi)容33-34
• 1.5.2 本研究的技術(shù)路線34-36
• 第2章 實驗材料與方法36-50
• 2.1 實驗材料36-39
• 2.1.1 細胞系及原代細胞36
• 2.1.2 病毒載體36
• 2.1.3 主要儀器36-37
• 2.1.4 主要實驗試劑37-38
• 2.1.5 實驗用小鼠38
• 2.1.6 主要試劑配置38-39
• 2.2 實驗方法39-48
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)39-40
• 2.2.2 病毒感染40-41
• 2.2.3 最佳轉(zhuǎn)染濃度測定41
• 2.2.4 Ad LTR2EF1α-EGFP載體轉(zhuǎn)基因表達測定41-42
• 2.2.5 Ad LTR2EF1α-IL-24載體轉(zhuǎn)基因表達測定42
• 2.2.6 IL-24外分泌表達檢測42-43
• 2.2.7 MTT檢測細胞活性43
• 2.2.8 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡43
• 2.2.9 TUNEL法檢測細胞凋亡43-44
• 2.2.10 細胞周期檢測44-45
• 2.2.11 MDC染色檢測自噬體45
• 2.2.12 透射電鏡45
• 2.2.13 GFP-LC3 染色檢測自噬體45-46
• 2.2.14 免疫印跡（Western blotting）46-48
• 2.2.15 動物實驗48
• 2.2.16 免疫組化48
• 2.2.17 統(tǒng)計學分析48
• 2.3 本章小結(jié)48-50
• 第3章 IL-24重組體在OSCC細胞中的表達及其作用50-70
• 3.1 引言50
• 3.2 IL-24重組體最佳感染濃度測定50-53
• 3.3 IL-24在OSCC細胞中的表達53-59
• 3.3.1 IL-24重組體在OSCC細胞中的基因轉(zhuǎn)錄情況53-55
• 3.3.2 IL-24重組體感染后OSCC細胞中IL-24蛋白的表達情況55-59
• 3.4 IL-24重組體抑制口腔鱗狀細胞癌的生長59-69
• 3.4.1 IL-24重組體抑制口腔鱗癌細胞的增殖59-61
• 3.4.2 IL-24重組體對口腔鱗癌細胞周期的影響61-63
• 3.4.3 IL-24重組體抑制口腔鱗狀細胞癌移植瘤的生長63-66
• 3.4.4 IL-24重組體對荷瘤裸鼠正常臟器形態(tài)的影響66-69
• 3.5 本章小結(jié)69-70
• 第4章 IL-24影響OSCC細胞凋亡與自噬作用的研究70-86
• 4.1 引言70
• 4.2 IL-24促進OSCC細胞的凋亡70-73
• 4.3 IL-24增強OSCC細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達及活性73-75
• 4.4 IL-24提高OSCC細胞的自噬水平75-84
• 4.4.1 IL-24重組體感染OSCC細胞誘發(fā)細胞自噬76-81
• 4.4.2 IL-24引起自噬相關(guān)蛋白表達的增加81-84
• 4.5 本章小結(jié)84-86
• 第5章 抑制自噬增強IL-24對OSCC細胞的增殖抑制作用86-103
• 5.1 引言86
• 5.2 自噬抑制劑 3-MA增強IL-24對OSCC細胞的生長抑制作用86-94
• 5.2.1 IL-24聯(lián)合 3-MA對KB細胞增殖活性的影響86-88
• 5.2.2 IL-24聯(lián)合 3-MA對KB細胞周期的影響88-90
• 5.2.3 IL-24聯(lián)合 3-MA對KB細胞移植瘤生長的影響90-94
• 5.3 3-MA增強IL-24對OSCC細胞增殖抑制作用機制的研究94-99
• 5.3.1 IL-24聯(lián)合 3-MA提高KB細胞的凋亡水平94-97
• 5.3.2 IL-24聯(lián)合 3-MA提高KB細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達量及活性97-99
• 5.4 自噬與凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的內(nèi)在聯(lián)系99-102
• 5.5 本章小結(jié)102-103
• 結(jié)論103-105
• 參考文獻105-118
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文及其它成果118-120
• 致謝120-121
• 個人簡歷121

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本文編號：842356