本文關(guān)鍵詞：自噬調(diào)控人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的機(jī)制研究

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【摘要】：【研究背景】近年來(lái),關(guān)于MSCs(mesenchymal stem cells)的相關(guān)研究已經(jīng)很多,并報(bào)道被用于治療人類(lèi)多種疾病。前期的研究表明,在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)中,應(yīng)用MSCs可以有效緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及促進(jìn)組織再生。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果也證明,MSCs可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中的血管化,并抑制皮膚增生性瘢痕的形成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMMSCs)是從骨髓中分離提取出來(lái)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞,已經(jīng)被大家公認(rèn)并被廣泛應(yīng)用于臨床。頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(jaw of bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)是來(lái)源于口腔中頜骨組織的一種成體干細(xì)胞,具有與BMMSCs相類(lèi)似的克隆形成能力及多向分化潛能。然而微環(huán)境的改變(如炎癥)嚴(yán)重影響JBMMSCs的生物學(xué)性能(如旁分泌功能),是導(dǎo)致其治療效果下降的重要原因。自噬(autophagy)是胞內(nèi)囊泡通過(guò)包裹錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器(如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome),將其內(nèi)容物降解并循環(huán)利用的行為,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝平衡及胞內(nèi)細(xì)胞器的更新。胞外信號(hào)調(diào)控激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)是一個(gè)很重要的調(diào)控細(xì)胞功能的激酶,并且與ATGs(autophagy-related genes)蛋白相互作用,當(dāng)敲除ATG5/7時(shí)會(huì)減少ERK的磷酸化。有研究報(bào)道自噬調(diào)控BMMSCs的功能從而提高其治療效果,但是關(guān)于自噬在JBMMSCs的旁分泌功能中起著何種作用及其作用機(jī)制并不是很明確。因此,在本課題中,我們首先比較了正常及炎癥組織來(lái)源JBMMSCs的自噬水平及其促ECs血管生成能力的不同,其次,研究了自噬對(duì)JBMMSCs旁分泌功能的調(diào)控及作用機(jī)制,為逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs的旁分泌功能以及對(duì)JBMMSCs生物學(xué)性能的深入研究提供了新的思路�！狙芯磕康摹�1.探討炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs的成骨及促ECs血管化功能的影響;2.探討炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs自噬水平的影響;3.探討自噬通過(guò)調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能從而影響ECs的血管化功能;4.探討通過(guò)上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平逆轉(zhuǎn)其促ECs的血管化功能;5.探討自噬調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能及作用機(jī)制�！狙芯糠椒ā康谝徊糠�:正常及炎癥組織來(lái)源的JBMMSCs生物學(xué)性能的比較。首先,我們從臨床上收集了頜骨骨髓炎患者的頜骨組織,參照正常頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(H-JBMMSCs)的分離培養(yǎng)方法,成功分離并培養(yǎng)了炎癥組織來(lái)源的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P-JBMMSCs)。其次,采用MTT、克隆形成(colony forming unit-fibroblasts,CFU-F)、成骨成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。最后,我們通過(guò)ALP、茜素紅染色和western blot檢測(cè)進(jìn)一步比較了兩種細(xì)胞成骨分化能力的差異,以及Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)與之共培養(yǎng)后ECs脈管形成能力的差異。第二部分:炎癥組織來(lái)源的JBMMSCs自噬水平的變化。首先,我們通過(guò)western blot和RT-PCR檢測(cè)了H-JBMMSCs和P-JBMMSCs中自噬相關(guān)基因LC3和Beclin-1的表達(dá)變化,同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察了LC3在細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況,最后通過(guò)透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞中自噬體的超微結(jié)構(gòu)及形成數(shù)量。第三部分:自噬調(diào)節(jié)JBMMSCs促ECs血管化。為了明確自噬在JBMMSCs促ECs血管化功能方面的作用,我們利用Rapamycin上調(diào)或轉(zhuǎn)染si-Beclin-1下調(diào)JBMMSCs的自噬水平,western blot檢測(cè)與其共培養(yǎng)后ECs中成血管相關(guān)蛋白VEGF、Ang II、PCNA的表達(dá)水平,Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)ECs脈管形成能力。在此過(guò)程中排除了自噬對(duì)ECs血管生成能力的直接影響。同時(shí)建立皮膚創(chuàng)面模型對(duì)體外結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,觀察注射JBMMSCs后第7天和14天創(chuàng)面愈合的大體照片,HE染色觀察創(chuàng)面愈合情況,倒置顯微鏡觀察創(chuàng)面愈合處新生毛細(xì)血管以及免疫熒光檢測(cè)創(chuàng)面愈合處血管相關(guān)因子CD31的表達(dá)。第四部分:Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促ECs的血管化。為了明確自噬和P-JBMMSCs促ECs血管生成能力下降的相關(guān)性,我們利用自噬的激活劑Rapamycin上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平后,western blot檢測(cè)與其共培養(yǎng)后ECs成血管相關(guān)蛋白VEGF、Ang II、PCNA的表達(dá)水平,Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)ECs脈管形成能力。進(jìn)一步建立皮膚創(chuàng)面模型對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,觀察注射細(xì)胞后第7天和14天創(chuàng)面的愈合大體照片,HE染色觀察創(chuàng)面愈合情況以及免疫熒光檢測(cè)創(chuàng)面愈合處血管相關(guān)因子CD31的表達(dá)。第五部分:自噬通過(guò)調(diào)控ERK通路促進(jìn)JBMMSCs旁分泌VEGF。為了明確自噬是通過(guò)調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能從而影響ECs的血管生成能力。我們首先通過(guò)RT-PCR篩選出與自噬關(guān)系最為密切的成血管因子,并驗(yàn)證該因子在ECs血管生成中的作用。進(jìn)一步通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERK和LC3的結(jié)合情況,western blot檢測(cè)Raf-MEK-ERK通路上相關(guān)蛋白的變化,抑制ERK通路后檢測(cè)VEGF是否發(fā)生變化,明確自噬是通過(guò)Raf-MEK-ERK通路調(diào)控JBMMSCs旁分泌VEGF�！狙芯拷Y(jié)果】第一部分:正常和炎癥組織來(lái)源的JBMMSCs成骨及促ECs血管生成能力的比較。1.成功地從正常及炎癥組織中分離培養(yǎng)出JBMMSCs,并驗(yàn)證其具有增殖能力及多向分化潛能;2.和H-JBMMSCs相比,P-JBMMSCs的成骨分化能力顯著下降;3.Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)P-JBMMSCs促ECs脈管生成能力也顯著低于H-JBMMSCs。第二部分:炎癥組織來(lái)源的JBMMSCs中自噬水平降低。1.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示P-JBMMSCs中自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)均下降;2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示P-JBMMSCs中LC3的表達(dá)減弱;3.透射電子顯微鏡觀察,結(jié)果顯示P-JBMMSCs中無(wú)明顯的自噬體形成。第三部分:自噬正向調(diào)節(jié)JBMMSCs促ECs血管生成能力。1.Rapamycin不能直接調(diào)控ECs的血管化功能;2.皮下注射細(xì)胞的方式較靜脈注射的方式更能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合;3.利用Rapamycin或轉(zhuǎn)染si-Beclin-1改變JBMMSCs的自噬水平,其促ECs血管生成能力也隨之改變;4.JBMMSCs自噬表達(dá)的改變對(duì)其凋亡無(wú)影響;5.進(jìn)一步的體內(nèi)結(jié)果表明,自噬可以調(diào)控JBMMSCs促進(jìn)創(chuàng)面皮膚血管化,從而加速創(chuàng)面的愈合。第四部分:Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促ECs的血管生成能力。1.單純涂抹Rapamycin對(duì)皮膚創(chuàng)面的愈合無(wú)明顯促進(jìn)作用;2.Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促ECs血管新生能力;3.皮下注射Rapamycin激活后的P-JBMMSCs,可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的血管新生,進(jìn)一步加速創(chuàng)面的愈合。第五部分:自噬通過(guò)激活ERK通路促進(jìn)JBMMSCs旁分泌VEGF。1.通過(guò)RT-PCR成功地篩選出與自噬相關(guān)的促血管生成因子VEGF;2.體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都得出,Rapamycin組VEGF的表達(dá)升高;3.VEGF促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合過(guò)程中的血管化;4.Rapamycin借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs旁分泌功能,從而促進(jìn)VEGF的分泌�！狙芯拷Y(jié)論】1.本課題成功地從正常及炎癥組織中分離培養(yǎng)了頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并對(duì)其增殖、克隆形成及成骨成脂分化能力進(jìn)行了鑒定。通過(guò)進(jìn)一步比較H-JBMMSCs和P-JBMMSCs生物學(xué)性能,發(fā)現(xiàn)炎癥因素導(dǎo)致頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨及促ECs血管生成能力下降。2.炎癥微環(huán)境影響頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬水平下降,這是導(dǎo)致頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促ECs血管功能下降的重要原因。3.自噬在JBMMSCs促ECs血管化方面發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。Rapamycin可以激活JBMMSCs促ECs的血管新生,而通過(guò)si-Beclin-1抑制細(xì)胞的自噬水平后,其JBMMSCs促ECs血管新生的能力降低。4.上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平,可以逆轉(zhuǎn)其對(duì)ECs血管化功能的作用。5.自噬借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs的旁分泌功能,促進(jìn)VEGF的分泌。分泌的VEGF作用于ECs,從而增強(qiáng)其血管新生能力。綜合以上結(jié)果,我們得出結(jié)論炎癥微環(huán)境影響JBMMSCs促ECs的血管化功能,然而自噬通過(guò)激活JBMMSCs的旁分泌VEGF從而正向調(diào)節(jié)其促ECs的血管化。本研究不僅加深了解了炎癥微環(huán)境對(duì)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性能的影響,而且明確自噬在頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,為更好、更清楚的研究頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 旁分泌 VEGF
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R781
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-35
• 第一部分 炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs成骨及促ECs血管形成能力的影響35-49
• 1 材料35-38
• 2 方法38-42
• 3 結(jié)果42-47
• 4 討論47-49
• 第二部分 炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs自噬水平的影響49-57
• 1 材料49-50
• 2 方法50-53
• 3 結(jié)果53-55
• 4 討論55-57
• 第三部分 自噬對(duì)H-JBMMSCs促ECs血管形成能力的影響57-73
• 1 材料57-58
• 2 方法58-63
• 3 結(jié)果63-71
• 4 討論71-73
• 第四部分 激活自噬逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs對(duì)ECs血管形成能力的影響73-81
• 1 材料73
• 2 方法73-74
• 3 結(jié)果74-79
• 4 討論79-81
• 第五部分 自噬通過(guò)激活ERK通路促進(jìn)VEGF分泌的機(jī)制研究81-94
• 1 材料81-82
• 2 方法82-85
• 3 結(jié)果85-92
• 4 討論92-94
• 小結(jié)94-95
• 參考文獻(xiàn)95-111
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果111-116
• 致謝116-117

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本文編號(hào)：823808