本文關(guān)鍵詞：腎上腺髓質(zhì)素對人牙髓干細胞的調(diào)控作用及機制研究

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【摘要】：目的當齲病進展侵犯到牙髓時,牙髓可以通過形成修復性牙本質(zhì)來保護牙髓的健康。DPSCs現(xiàn)在被認為是修復性牙本質(zhì)形成的一個重要來源,DPSCs具有多向分化的潛能,目前的研究認為成牙本質(zhì)分化對于牙髓損傷后修復性牙本質(zhì)的形成起到關(guān)鍵作用。然而目前DPSCs的增殖及分化機制尚未完全確定。研究顯示,ADM在牙齒的發(fā)育過程中,在關(guān)鍵的發(fā)育時間點呈現(xiàn)高表達,并且ADM對成骨現(xiàn)象存在明顯的調(diào)控作用,而成骨和成牙本質(zhì)具有很多的相似性。本課題組通過前期檢測離體牙牙髓組織的實驗發(fā)現(xiàn),相比于正常牙髓,牙髓損傷組織ADM明顯呈高表達,并且表達部位集中于損傷牙髓部位和修復性牙本質(zhì)周圍。因此本課題組推測ADM可能對DPSCs的增殖分化具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究旨在:(一)檢測ADM在齲病牙髓組織內(nèi)的表達情況以及ADM和齲壞程度的相關(guān)性。(二)體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代DPSCs。(三)通過在DPSCs培養(yǎng)基內(nèi)加入ADM刺激,研究ADM對DPSCs增殖、凋亡的調(diào)控作用以及其作用機制。(四)研究ADM對DPSCs的成牙本質(zhì)分化的調(diào)控作用及其作用機制。方法1.齲壞程度和ADM表達水平的相關(guān)性研究收集我院臨床拔除的智齒195例,包括齲病95例(根據(jù)齲病分類分為淺齲44例、中齲32例、深齲19例)和健康離體牙100例,拔除后立即取出牙髓組織,ELISA檢測ADM在牙髓液中的表達水平,免疫組織化學檢測ADM在牙髓組織中的表達及細胞定位,利用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。2.DPSCs的培養(yǎng)和鑒定利用臨床拔除的健康離體牙的牙髓組織剪碎進行培養(yǎng),采用酶消化及過濾的方法得到單細胞懸液,有限稀釋法原代培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)細胞至第3代,細胞免疫熒光檢測STRO-1/CD146等DPSCs標志物的表達。體外誘導分化后檢測ALP活性,礦化結(jié)節(jié)形成情況,以及DSP表達,明確DPSCs是否具有成牙本質(zhì)分化的潛能。3.adm對dpscs增殖、凋亡的調(diào)控作用及機制研究原代dpscs培養(yǎng)至第3代,加入不同濃度adm干預后,通過流式細胞檢測細胞周期及細胞凋亡情況,通過westernblot檢測凋亡蛋白的表達,觀察adm對于dpscs增殖能力的影響。通過westernblot檢測調(diào)控細胞增殖關(guān)鍵信號通路蛋白jnk/c-jun的表達和磷酸化水平,以及調(diào)控細胞凋亡關(guān)鍵信號通路蛋白src/gsk-3β的表達和磷酸化水平。此外通過adm及jnk/c-jun通路抑制劑sp600125共處理,以及adm與src/gsk-3β通路抑制劑pp2共處理,探討adm是否通過激活src/gsk-3β通路及src/gsk-3β通路分別調(diào)控dpscs增殖及凋亡的。4.adm對dpscs成牙本質(zhì)分化的作用及機制研究原代dpscs培養(yǎng)至第3代,加入adm(10-8mol/l)處理24小時,通過westernblot檢測成牙本質(zhì)分化相關(guān)標志蛋白的表達,同時檢測creb及磷酸化creb、bmp2表達水平。通過熒光素酶活性報告實驗以及chip檢測creb對于bmp2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。此外,在adm處理細胞同時加入h89抑制creb磷酸化,或在adm處理細胞同時加入noggin抑制bmp通路,觀察adm是否通過激活creb/bmp通路進而促進dpscs成牙本質(zhì)分化。結(jié)果1.齲病和adm表達水平的相關(guān)性研究elisa檢測結(jié)果顯示:齲壞組的牙髓組織液中adm水平顯著高于健康組,此外發(fā)現(xiàn),在深齲組、中齲組、淺齲組的牙髓組織液中深齲組adm水平顯著高于中齲組和淺齲組,中齲病人adm水平顯著高于淺齲組。通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)adm在齲壞相鄰的牙髓范圍內(nèi)染色顯示高表達,并且在修復性牙本質(zhì)周圍更為顯著。2.dpscs的培養(yǎng)和鑒定7天后少數(shù)細胞增殖能力旺盛形成克隆,細胞呈stro-1及cd146陽性。礦化誘導培養(yǎng)后,細胞可形成礦化結(jié)節(jié),alp活性顯著升高,westernblot檢測顯示細胞表達dsp蛋白。3.adm對dpscs增殖、凋亡的調(diào)控作用及機制研究10~(-7)m-10-10madm處理細胞后24hr,adm處理組g2/s/m期細胞比例顯著上升而細胞倍增時間顯著低于空白對照組,其中10~(-7)m及10-8madm處理組無顯著差異,但促進dpscs增殖的作用顯著高于其他2組。10-8madm處理后,dpscs中jnk/c-jun蛋白磷酸化水平明顯增加,10-8madm聯(lián)合10μmsp600125處理后,jnk/c-jun磷酸化水平降低,細胞增殖能力顯著下降。10~(-7)m-10-10madm處理細胞后24hr,adm處理組細胞凋亡率及caspase3表達水平顯著下降,其中10~(-7)M及10-8M ADM處理組之間無顯著差異,但抑制DPSCs凋亡的作用顯著高于其他2組。10-8M ADM處理后,DPSCs中Src/GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著增加,10-8M ADM聯(lián)合20μM PP2處理DPSCs,Src/GSK-3β磷酸化水平降低,細胞凋亡率顯著上升。4.ADM對DPSCs成牙本質(zhì)分化的作用及機制研究10~(-7) M ADM處理DPSCs后,Alizarin red S染色水平顯著高于對照組。Western blot檢測結(jié)果顯示,ADM處理組RUNX2/ALP/OCN蛋白表達水平均顯著高于對照組。此外,ADM處理組p CREB表達水平較對照組顯著上升,但細胞總CREB水平未見顯著變化。定量PCR和Western blot結(jié)果顯示ADM處理組BMP2 mRNA和蛋白表達水平均較對照組顯著上升。熒光素酶活性報告及ChIP結(jié)果顯示CREB可通過結(jié)合BMP2啟動子-1094至-669區(qū)域促進BMP2的轉(zhuǎn)錄。10~(-7) M ADM/5μM H89共處理后p CREB/BMP2/RUNX2/ALP/OCN表達水平均顯著低于單獨ADM處理,而10~(-7) M ADM/100ng mL Noggin共處理后RUNX2/ALP/OCN表達水平均顯著低于單獨ADM處理。結(jié)論1.ADM在齲病牙髓組織高表達,并且與齲病的進展呈現(xiàn)正相關(guān)。2.從成體人牙髓組織中可分離培養(yǎng)出DPSCs,具有成牙本質(zhì)分化能力。3.ADM通過激活JNK/c-Jun信號通路促進DPSCs的增殖,通過激活Src/GSK-3β信號通路抑制DPSCs凋亡。4.ADM通過促CREB磷酸化進而上調(diào)BMP轉(zhuǎn)錄表達的途徑促進DPSCs成牙本質(zhì)分化。
【關(guān)鍵詞】：腎上腺髓質(zhì)素 人牙髓干細胞 增殖 凋亡 成牙本質(zhì)分化 JNK/c-Jun信號通路 Src/GSK-3β信號通路 CREB BMP
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-19
• 1.1 研究背景14-15
• 1.2 課題設計15-17
• 參考文獻17-19
• 第二章 齲病和ADM的相關(guān)性研究19-31
• 2.1 前言19
• 2.2 材料與方法19-24
• 2.3 結(jié)果24-27
• 2.4 討論27-28
• 2.5 結(jié)論28-29
• 參考文獻29-31
• 第三章 人DPSCs的體外培養(yǎng)和鑒定31-42
• 3.1 前言31
• 3.2 材料與方法31-34
• 3.3 結(jié)果34-38
• 3.4 討論38-39
• 3.5 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-42
• 第四章 ADM對DPSCs增殖和凋亡的作用及機制研究42-61
• 4.1 前言42
• 4.2 材料與方法42-49
• 4.3 結(jié)果49-55
• 4.4 討論55-57
• 4.5 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-61
• 第五章 ADM對DPSCs成牙本質(zhì)分化的作用及機制研究61-86
• 5.1 前言61-62
• 5.2 材料與方法62-73
• 5.3 結(jié)果73-79
• 5.4 討論79-80
• 5.5 結(jié)論80-81
• 參考文獻81-86
• 全文總結(jié)86-88
• 文獻綜述一 ADM在牙體組織中的作用88-97
• 參考文獻92-97
• 文獻綜述二 DPSCs以及iPS的應用及未來97-109
• 參考文獻103-109
• 攻讀學位期間的研究成果109-110
• 致謝110

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