發(fā)布時間：2017-08-18 21:19

  本文關鍵詞：CD63對TCA8113細胞侵襲轉移影響的初步研究

  更多相關文章： 舌癌 CD63 RNA干擾 侵襲 轉移

【摘要】：目的通過免疫組化技術,探尋CD63表達量與舌鱗狀細胞癌病理分化程度之間的關系,通過RNA干擾技術和體外轉染技術改變舌鱗癌細胞TCA8113細胞CD63的表達量,篩選低表達和過表達CD63蛋白的TCA8113細胞株,初步探索CD63表達量的改變對舌鱗癌細胞侵襲轉移的影響。方法1、選取32例不同病理分化程度的舌癌組織樣本,應用免疫組織化學技術分析舌癌組織分化程度和CD63表達量之間的關系。2、根據(jù)人CD63的m RNA序列(NM_001780.5),設計3個針對該序列的sh RNA編碼克隆,插入含有h U6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin元件的基因沉默表達質粒GV102中,轉染293T細胞,48h后采用Real-Time PCR及Western Blot檢測干擾效率并篩選最有效的干擾片段,將有效sh RNA質粒瞬時轉染TCA8113細胞,G418篩選得到CD63消減沉默的穩(wěn)定細胞株,命名為CD63-L。3、設計CD63特異性引物,提取TCA8113細胞總RNA,RT-PCR方法構建PEGFP-N3-CD63真核表達質粒,經(jīng)酶切和測序正確后瞬時轉染TCA8113細胞,G418篩選得到過表達CD63的穩(wěn)定細胞株,命名為CD63-H,采用Western Blot方法檢測CD63表達,共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達和定位。4、Western Blot檢測正常TCA8113細胞(CON)、CD63消減沉默細胞(CD63-L)、CD63過表達細胞(CD63-H)基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達量的差異,劃痕實驗檢測三種細胞系劃痕愈合速度的差異,transwell實驗檢測CON、CD63-L、CD63-H三株細胞特定時間點穿過基質膜的細胞數(shù)量,分析不同CD63表達量對TCA8113細胞侵襲轉移能力的影響。結果1、正常舌組織內(nèi)CD63呈棕黃色顆粒狀著色,著色程度較深,主要表達于細胞膜和細胞質。隨著舌鱗癌組織分化程度降低,著色程度逐漸變?nèi)?且均弱于正常舌組織,方差分析各組間CD63表達量的差異,P0.05,說明CD63表達量與舌癌組織分化程度之間成正相關關系。經(jīng)t檢驗得知,隨著舌癌分化程度降低,CD63表達量降低,而舌癌發(fā)生淋巴結轉移的可能性增加,P0.05,即CD63表達量和舌癌淋巴結轉移間成負相關關系。2、sh RNA質粒能夠高效轉染293T細胞,Real-Time PCR及Western Blot結果顯示,CD63-RNAi-4041干擾效果最好,在m RNA水平和蛋白水平干擾效率分別為88%和74%,經(jīng)方差分析,P0.05。采用600ug/ml G418篩選,成功獲得CD63消減沉默的TCA8113細胞株,命名為CD63-L。3、經(jīng)酶切鑒定和測序,成功構建PEGFP-N3-CD63真核表達質粒。經(jīng)600ug/ml G418篩選,得到穩(wěn)定高表達CD63的TCA8113細胞株,與正常未轉染細胞相比,CD63表達增加32%,命名為CD63-H,共聚焦顯微鏡觀察CD63蛋白主要表達于細胞膜。4、Western Blot結果示,與CON相比,CD63-L細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9表達量分別升高60%、61%,而CD63-H細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9表達量分別減低29%、41%,經(jīng)方差分析,均有P0.05。細胞劃痕實驗結果示,與CON組相比,CD63-L細胞愈合速度增快73%,而CD63-H相比愈合速度減慢約59%。Transwell實驗表明,CD63-L穿膜細胞數(shù)量較CON增多約70%,而CD63-H穿膜細胞數(shù)量較CON減少約68%,經(jīng)方差分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。結論1、舌鱗癌組織樣本中CD63表達量與腫瘤分化程度成正相關,與舌癌是否發(fā)生淋巴結轉移成負相關。2、成功篩選得到CD63消減沉默的TCA8113細胞株CD63-L。3、成功篩選得到CD63過表達的TCA8113細胞株CD63-H。4、MMP-2、MMP-9表達量、細胞劃痕愈合速度、穿膜細胞的數(shù)量均與CD63表達量成反比,初步探明CD63表達量與舌癌細胞侵襲轉移能力成負相關。
【關鍵詞】：舌癌 CD63 RNA干擾 侵襲 轉移
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.86
【目錄】：

• 中文論著摘要5-8
• 英文論著摘要8-12
• 英文縮略語表12-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-28
• 結果28-44
• 討論44-49
• 結論49-50
• 本研究創(chuàng)新性的自我評價50-51
• 參考文獻51-54
• 綜述54-62
• 參考文獻58-62
• 在學期間科研成績62-64
• 致謝64-66
• 個人簡介66-67

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