目的 構(gòu)建脊椎骨骺發(fā)育不良蛋白Sedlin的缺失突變體和點突變體質(zhì)粒,檢測其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位及其與RB1蛋白的共定位情況,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了Sedlin突變體與RB1突變體相互作用研究,以及通過RNA干擾（siRNA和shRN A）技術(shù)探索Sedlin在哺乳動物細(xì)胞中的功能,及其對RB1參與細(xì)胞周期調(diào)控的影響。方法 以Sedlin全長cDNA序列為模板,擴(kuò)增目的基因序列,連接至表達(dá)載體,構(gòu)建3個原核表達(dá)質(zhì)粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相應(yīng)的真核表達(dá)質(zhì)粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分別單轉(zhuǎn)pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及將上述質(zhì)粒分別與pDNA3.1-FLAG-RB1/-N/-C共轉(zhuǎn)到COS7細(xì)胞中,免疫熒光制片,觀察其在真核細(xì)胞內(nèi)的定位及共定位情況;制備GST-SedlinN融合蛋白,轉(zhuǎn)染pDNA3.1-FLAG-RB1-N質(zhì)粒至HEK 293T細(xì)胞,進(jìn)行GST pulldown實驗,探究二者在細(xì)胞外的相互作用情況;在HEK 293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)pCDGFP-SedlinN和pDNA3.1-FLAG... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖

圖 2 Sedlin 及其突變體蛋白在 COS7 細(xì)胞中的定位DAPI：細(xì)胞核； MERGE：疊加效果ig. 2 Localization of Sedlin and its mutant proteins in COS7 cellsDAPI indicates nucleus.蛋白與 RB1 突變體蛋白（RB1/-N/-C）的共定位研究在之前的研究已經(jīng)證明 Sedlin 與 RB1 的 N 端和 C 端均存在光共聚焦技術(shù)進(jìn)一步驗證了此結(jié)果，見圖 3。

圖 3 Sedlin 蛋白與 RB1 突變體蛋白（RB1-N/-C）在 COS7 細(xì)胞中的共定位DAPI：細(xì)胞核； MERGE：疊加效果olocalization of Sedlin protein and RB1 mutant proteins（RB1-N/-C）in COS7 cellDAPI indicates nucleus.edlin 突變體蛋白（Sedlin-N）與 RB1 突變體蛋白（RB1/-N/-C）的共定位Sedlin 與 RB1 的 N 端和 C 端均存在共定位的基礎(chǔ)上，我們分別共轉(zhuǎn)了 S體質(zhì)粒 pcDGFP-SedlinN 與 pcDNA3.1-FLAG-RB1/-N/-C 至 COS7 細(xì)胞中熒光制片并且通過激光共聚焦顯微鏡拍攝，結(jié)果顯示，SedlinN 蛋白與 白在核內(nèi)均存在明顯的共定位，但與 RB1-N 蛋白不存在共定位，見圖 4dlin 的 C 端缺失并不影響其與 RB1 的共定位，提示 Sedlin 的 N 端可能是 相互結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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