背景 牙齒外傷為兒童和青少年常見的口腔頜面部損傷之一,其發(fā)生率為15-21%,而牙脫位(美國兒科牙學會將其定義為“牙齒完全從牙槽窩中移位”)是牙齒外傷中最嚴重的一種,約占恒牙外傷的16%。當牙脫位時,除了牙周膜(periodontal ligament, PDL)完全撕裂外,還伴有局部牙骨質(zhì)、牙槽骨和附著組織的損傷以及牙髓壞死等。牙脫位若治療不當則很容易造成牙齒缺失,影響到傷者的面容美觀和咀嚼功能,更有甚者還有可能影響到青少年傷者的心理健康發(fā)育。 治療牙脫位的最好方法是即刻再植,即刻再植不僅能迅速恢復PDL的營養(yǎng)支持,而且能最大化地維持牙根面牙周膜細胞(periodontal ligament cells, PDLC)的活性和增殖能力,提高功能性愈合(functional healing, FH)的幾率,進而能最大限度的保存患牙,維護牙列的完整性和美觀性。雖然即刻再植治療脫位牙能得到最好的預后,但即刻再植通常很難實現(xiàn)。不過,對于不能即刻再植的脫位牙則應最大限度地保存殘留在牙根面上的PDLC活性,來提高脫位牙延時再植的成功率。據(jù)報道,牙根面存留的有活性的PDLC隨著體外干燥時間的延長而減少,脫位牙體外干燥2h后根面幾乎找不到活細胞。Cvek等的調(diào)查研究顯示脫位后干燥放置15min、20～40min和60min的牙齒再植后分別有13%、40%和100%的牙齒發(fā)生了置換性吸收,而造成再植牙失敗的主要原因是牙根的炎癥性吸收(inflammatory resorption, IR)和置換性吸收(replacement resorption, RR)。 Andreasen JO對影響再植牙形成FH的因素進行分析后發(fā)現(xiàn),對形成FH有影響的因素由強至弱依次為牙根發(fā)育階段、體外干燥放置時間、即刻再植和體外濕保存時間。再有,許多研究結果顯示與縮短口外放置時間比較,用保存介質(zhì)保存PDLC活性來預防脫位牙再植后的RR和IR則更為關鍵。 理想的脫位牙保存介質(zhì)應具有生理性滲透壓和pH值、能保存PDLC的活性、粘附力和增殖能力、以及容易獲得且保質(zhì)期長等特性。HBSS液(Hank's balanced salt solution)是美國牙髓醫(yī)師學會推薦的最佳牙齒保存液,含有細胞生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì),滲透壓290-320mOsm/L,pH值7.2,適宜細胞生長。但是因為在藥店里無售而一直沒有被廣泛使用。牛奶因為含細菌量低,并且含有少量細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子而被廣泛接受,但是它的效果是否與HBSS液一樣還存在爭議,有報道認為它只能在3h內(nèi)保存細胞活性。器官保存液ViaSpan(?)也被研究用做PDLC的保存介質(zhì),它能有效保存唇成纖維細胞活性至168h,且在ViaSpan(?)中保存6h和12h的狗牙再植后既未發(fā)生IR,也未發(fā)生RR。雖然ViaSpan(?)斃長時間地保存細胞活性,但因價格昂貴而不適于普遍使用。Buttke TM認為ViaSpan(?)含有的還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)能分解過氧化氫,保護PDLC免受氧化損傷；他的研究也證實在添加了100U/ml過氧化氫酶的HBSS液中保存過的狗脫位牙,再植后的根面吸收率顯著低于未添加過氧化氫酶的HBSS液組。 德國Dentosafe(?)公司生產(chǎn)了一種名為牙科急救箱的脫位牙齒保存液,被瑞士和澳洲引進放在易發(fā)生牙外傷的高風險區(qū)——中小學校,體外實驗表明這種牙齒保存液能在室溫下保存PDLC活性和增殖能力至48h。有報道對使用了牙科急救箱的6顆脫位牙做了長期隨訪,保存時間為1-53h,這些牙齒再植后全部形成了牙周膜愈合。由此可見,選擇適當?shù)谋４娼橘|(zhì)濕保存脫位牙,對于保存牙根面PDLC的活性,提高再植牙的FH是非常重要的。 目前我國對脫位牙齒保存液的研究甚少,也沒有商業(yè)化的脫位牙齒保存液出售,本研究目的是以HBSS液為基礎,將配制的改良HBSS液與HBSS液比較,探討其保存人PDLC生物學活性的效果,進而為研究商業(yè)化脫位牙齒保存液提供初步實驗依據(jù)。 第一章人PDLC的原代培養(yǎng)及細胞來源鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)人PDLC,對細胞來源進行鑒定。 方法： 1、分離培養(yǎng)人PDLC門診收集因正畸需要拔除的無齲壞及其它牙體、牙周組織疾病的上頜或下頜前磨牙,刮取根中1/3牙周膜組織,采用酶消化聯(lián)合組織塊法培養(yǎng)。消化液由3mg/ml I型膠原酶和4mg/ml中性蛋白酶以體積比1：1混合而成。 2、人PDLC來源鑒定通過免疫組織化學方法檢測培養(yǎng)細胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達,對細胞來源進行初步鑒定。 3、繪制人PDLC生長曲線用MTS試劑測定并繪制培養(yǎng)的人PDLC生長曲線。 結果： 1、形態(tài)學特征：原代培養(yǎng)第5d即可看到細胞從組織塊游出,細胞形態(tài)無明顯差別,多數(shù)呈長梭形,少數(shù)為多角形,紡錘狀,體積較小,內(nèi)有圓形細胞核。原代培養(yǎng)12d細胞即達到80%匯合,此時細胞連接成片,排列具有一定的方向性,呈漩渦狀。經(jīng)HE染色可見細胞核呈圓形藍染,胞質(zhì)紅染。 2、免疫組織化學特征：免疫組化顯示細胞抗波形絲蛋白染色陽性,胞質(zhì)內(nèi)有褐色陽性顆粒均勻分布,而抗角蛋白染色陰性,胞質(zhì)內(nèi)未見褐色陽性顆粒,表明細胞較為單一,符合間葉來源細胞特征,且無上皮細胞污染,證實所分離培養(yǎng)的是人PDLC,可用于進一步的研究。 3、生長曲線特點：經(jīng)MTS法測得的人PDLC生長曲線顯示,細胞接種后48h內(nèi)生長緩慢,此后細胞生長逐漸加快,第3d進入對數(shù)生長期,第7d進入平臺期。 第二章改良HBSS液對體外培養(yǎng)人牙周膜細胞增殖活性的影響 目的：以HBSS液為基礎液配制成改良HBSS液,用MTS法檢測改良HBSS液 保存的體外培養(yǎng)人PDLC增殖活性的變化。 方法： 1、在HBSS液中添加終濃度各為100U/ml的青霉素和鏈霉素,無水酒精溶解地塞米松后加入HBSS液中使其終濃度為8mg/L。將上述HBSS液充分混勻后分成三等份,分別添加GSH使其終濃度分別為1mmol/L、3mmol/L和5mmol/L,然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值在7.2-7.4之間,最后過濾消毒待用。 2、取生長良好的第4代人PDLC鋪于96孔板,用MTS法測定人PDLC于室溫(25℃)下在上述三種改良HBSS液、HBSS液、HC-A離體腎保存液及蒸餾水中存放0.5～48h后的增殖活性變化。 結果： 1、MTS法檢測結果顯示：HBSS液組和改良HBSS液組的細胞增殖活性(OD值)在0.5～48h內(nèi)均顯著高于HC-A液組和蒸餾水組(P0.05), HC-A液組和蒸餾水組之間差異始終無顯著意義(P0.05)；含3mmol/L和5mmol/LGSH的改良HBSS液組在1-12h顯著高于HBSS液組(P0.05)；含lmmol/LGSH的改良HBSS液組在2-6h顯著高于HBSS液組(P0.05),其中,含5mmol/LGSH改良HBSS液組在2-12h顯著高于含GSH的其它濃度組(P0.05)。但含1mmol/LGSH的改良HBSS液組在1h、12h時與HBSS液組差異無顯著意義(P0.05)；另外,改良HBSS液組與HBSS組在24～48h間均差異無顯著意義(P0.05)。 第三章改良HBSS液對體外培養(yǎng)人牙周膜細胞存活和克隆能力的影響 目的：用臺盼藍染色法和細胞平板克隆形成實驗檢測改良HBSS液保存體外培養(yǎng)人PDLC的效果。 方法： 1、取生長良好的第4代人PDLC,在上述三種改良HBSS液、HBSS液及蒸餾水中保存0.5～48h后,用臺盼藍染色法鑒定活細胞與死細胞,并計算存活細胞百分率。 2、未用于臺盼藍染色的細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋,以50,100,200個細胞的密度分別接種至含2.5ml37℃預溫培養(yǎng)液的6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼能看到克隆時終止培養(yǎng),并計算存活細胞克隆形成率。 結果 1、存活細胞百分率：含3mmol/L和5mmol/L GSH的改良HBSS液組在2～24h顯著高于HBSS液組,且含5mmol/L GSH的改良HBSS液組在2～24h時顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組(P0.05),含3mmol/L GSH的改良HBSS液組在6-24h顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組(P0.05)；含3mmol/L和5mmol/L GSH組之間差異始終無顯著意義(P0.05)；含1mmol/L GSH的改良HBSS液與HBSS液組之間差異始終無顯著意義(P0.05)；改良HBSS液組和HBSS液組在0.5、1h及48h時差異始終無顯著意義(P0.05)。而蒸餾水組在0.5h時已無細胞存活。 2、存活細胞克隆形成率：含5mmol/L GSH的改良HBSS液組在1-12h顯著高于HBSS液組(P0.05),在2-12h顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組(P0.05),在6-12h時顯著高于含3mmol/L GSH的改良HBSS液組(P0.05)；含3mmol/L GSH的改良HBSS液組在1-6h顯著高于HBSS液組(P0.05),僅在2h時顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組(P0.05)；含1mmol/L GSH的改良HBSS液僅在6h時顯著高于HBSS液組(P0.05); HBSS液組和改良HBSS液組的克隆形成率在0.5、24h及48h時差異始終無顯著意義(P0.05)。 結論 1、改良HBSS液在12h內(nèi)保存的人PDLC增殖活性以及存活細胞克隆形成率均明顯高于HBSS液,而且這種效果隨GSH濃度的升高而增強。 2、含5mmol/L GSH的改良HBSS液是較好的體外培養(yǎng)人PDLC保存液。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R781
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 人牙周膜細胞的原代培養(yǎng)及細胞來源鑒定
    1.1 引言
    1.2 材料與方法
    1.3 結果
    1.4 討論
    1.5 結論
第二章 改良HBSS液對體外培養(yǎng)人牙周膜細胞增殖活性的影響
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
    2.3 結果
    2.4 討論
    2.5 結論
第三章 改良HBSS液對體外培養(yǎng)人牙周膜細胞存活和克隆能力的影響
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
    3.3 結果
    3.4 討論
    3.5 結論
全文總結
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學校期間成果
致謝

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