發(fā)布時間：2020-11-15 18:11

　　 舍格倫綜合征是一種可以引起外分泌腺分泌功能障礙的慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病。根據(jù)臨床特征可以分為兩種類型：原發(fā)性舍格倫綜合征和繼發(fā)性舍格倫綜合征。原發(fā)性舍格倫綜合征特點(diǎn)是干燥性角結(jié)膜炎和口干癥；繼發(fā)性舍格倫綜合征是原發(fā)性的癥狀伴發(fā)其他部位的自身免疫疾病,例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和硬皮病等。舍格倫綜合征的發(fā)病率為0.5-3%,女性中多見(是男性患者人數(shù)的9倍)。舍格倫綜合征的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚,多種因素與其發(fā)病相關(guān),例如內(nèi)分泌因素、遺傳因素、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等,但最關(guān)鍵的致病因素是免疫系統(tǒng)的異常。 IL-21是一種具有多種功能的I型細(xì)胞因子,在淋巴細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化過程中,尤其在抗體產(chǎn)生和漿細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時,很多研究也證明IL-21參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)展過程,例如感染性腸病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等,所以IL-21也被當(dāng)做自身免疫性疾病治療中的一種關(guān)鍵因子和治療靶位。但I(xiàn)L-21在舍格倫綜合征的作用尚不清楚,IL-21在舍格倫綜合征發(fā)病中的作用和具體機(jī)制值得深入研究。 因此,為了搞清IL-21在舍格倫綜合征發(fā)病過程中的作用及其機(jī)制,我們選用了常用的舍格倫綜合征模型動物NOD小鼠作為研究對象,通過在NOD小鼠中阻斷IL-21信號通路,觀察IL-21對NOD小鼠舍格倫綜合征樣癥狀的影響,并進(jìn)一步優(yōu)化NOD小鼠體內(nèi)IL-21的干擾手段后,對IL-21在舍格倫綜合征發(fā)病過程中的具體機(jī)制進(jìn)行深入的研究。 第一部分：在NOD小鼠體內(nèi)阻斷IL-21信號對舍格倫綜合征發(fā)病的影響 目的：使用融合蛋白IL-21R.Fc競爭性阻斷IL-21與IL-21受體的結(jié)合,抑制NOD小鼠體內(nèi)IL-21信號通路,檢測NOD小鼠舍格倫綜合征癥狀的變化,從而研究IL-21對舍格倫綜合征發(fā)病的影響。 方法：利用分子克隆技術(shù)以小鼠cDNA為模版分別PCR擴(kuò)增IL-21受體胞外區(qū)片段和小鼠IgG2a的Fc片段,其中Fc片段的235、3]8、320和322為氨基酸進(jìn)行誘導(dǎo)定點(diǎn)突變,以減少Fc受體結(jié)合活性和補(bǔ)體激活能力。然后將IL-21受體胞外區(qū)片段和Fc段基因插入質(zhì)粒pcDNA3.1+構(gòu)建成融合蛋白IL-21R.Fc的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc。(?)勾建好的質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液利用親和層析法對融合蛋白進(jìn)行純化,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)。將純化的融合蛋白IL-21R.Fc通過尾靜脈注射作用于NOD小鼠體內(nèi),定期檢測唾液流速和頜下腺HE染色病理切片,對NOD小鼠的唾液分泌功能和頜下腺炎癥浸潤情況進(jìn)行評價。 結(jié)果：質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后成功表達(dá)并純化得到融合蛋白IL-21R.Fc。通過融合蛋白IL-21R.Fc在NOD小鼠體內(nèi)對IL-21信號的抑制作用,緩解了NOD小鼠的舍格倫綜合征癥狀。唾液分泌功能障礙的進(jìn)展減慢,頜下腺中的淋巴細(xì)胞浸潤也得到了緩解。 結(jié)論：IL-21信號在NOD小鼠的舍格倫綜合征發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的致病作用。對IL-21信號的阻斷和抑制可能作為舍格倫綜合征的一種有效治療手段。 第二部分：在NOD小鼠頜下腺局部抑制IL-21表達(dá)對舍格倫綜合征的影響機(jī)制 目的：使用表達(dá)IL-21shRNA的慢病毒表達(dá)載體通過頜下腺導(dǎo)管逆行灌注,在NOD小鼠頜下腺中長期抑制IL-21的表達(dá),觀察對NOD小鼠舍格倫綜合征的影響,并對IL-21的作用機(jī)制進(jìn)行研究分析。 方法：通過IL-21shRNA的慢病毒載體逆行灌注NOD小鼠頜下腺,檢查慢病毒對IL-21表達(dá)的抑制效果,定期檢測唾液流速和頜下腺淋巴浸潤情況。利用實(shí)時定量PCR對輔助T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平進(jìn)行檢測,研究IL-21抑制對NOD小鼠頜下腺中各種細(xì)胞因子的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)法對NOD細(xì)胞中的CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞進(jìn)行檢測,觀察IL-21抑制對Tfh細(xì)胞的影響。 結(jié)果：IL-21shRNA的慢病毒表達(dá)載體明顯抑制了IL-21在NOD小鼠頜下腺中的表達(dá),并緩解了NOD小鼠的唾液分泌功能障礙和頜下腺淋巴浸潤的進(jìn)展。通過對NOD小鼠頜下腺中多種細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行的實(shí)時定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)IL-21的抑制對Tfh細(xì)胞相關(guān)的CXCR5和BCL-6有明顯的抑制作用。NOD小鼠頜下腺中CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比率在IL-21的表達(dá)受到抑制后得到明顯降低,免疫組織化學(xué)法也發(fā)現(xiàn)頜下腺中CXCR5+細(xì)胞隨著IL-21的抑制而減少。 結(jié)論：在NOD小鼠頜下腺中局部抑制IL-21緩解了頜下腺的分泌功能障礙和淋巴細(xì)胞浸潤的進(jìn)展,延緩了舍格倫綜合征在NOD小鼠頜下腺中的發(fā)展。IL-21的抑制主要通過影響Tfh細(xì)胞的分化發(fā)育,從而影響了生發(fā)中心的形成和自身反應(yīng)性的漿細(xì)胞的成熟。 綜上所述,本課題證實(shí)了IL-21在舍格倫綜合征發(fā)病過程中的重要致病作用,并且.驗(yàn)證了局部抑制IL-21在治療舍格倫綜合征中的有效性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)IL-21通過影響Tfh細(xì)胞的分化發(fā)育,影響了頜下腺中生發(fā)中心的形成和自身反應(yīng)性的漿細(xì)胞的成熟,從而導(dǎo)致了舍格倫綜合征的發(fā)展。進(jìn)一步探索IL-21的干預(yù)手段對舍格倫綜合征的治療有著重要的意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R781.7
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
前言
第一部分 在NOD小鼠體內(nèi)阻斷IL-21信號對舍格倫綜合征發(fā)病的影響
    材料和方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第二部分 在NOD小鼠頜下腺局部抑制IL-21表達(dá)對舍格倫綜合征的影響機(jī)制
    材料和方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章
附英文論文
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 袁雙龍;蔣莉;張曉莉;李舒帆;段宏梅;王曉非;;原發(fā)性干燥綜合癥患者血清IL-21水平及其臨床意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年02期

2 王曉非;袁雙龍;蔣力;張曉莉;李舒帆;郭韻;吳春玲;陳涓涓;;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清BAFF和IL-21的變化及意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年11期

本文編號：2885050