發(fā)布時間：2020-11-15 15:49

　　 牽張成骨(distraction osteogenesis, DO)技術(shù)最早源于矯形外科,用來矯正肢體長度缺陷,后來用于治療顱頜面的先天畸形。牽張成骨成功引入口腔頜面外科為常規(guī)技術(shù)難以矯正的骨缺損和畸形提供了新的方法和思路,它的臨床實踐效果不僅突破了傳統(tǒng)外科理論而且解決了許多傳統(tǒng)外科手段所無法解決的臨床難題。 牽張成骨過程中形成新骨的形態(tài)與、結(jié)構(gòu)和大小接近周圍原骨,無需植骨,避免了骨移植術(shù)的各種并發(fā)癥；骨周圍的軟組織,如肌肉、皮膚、神經(jīng)和血管,可同期同步擴(kuò)張；此外,牽張成骨手術(shù)創(chuàng)傷小。但牽張成骨的某些局限性如治療周期長、牽張過快過長導(dǎo)致新骨形成不良等問題限制了其在臨床上的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。因此,如何促進(jìn)牽張新骨形成與礦化,從而縮短牽張成骨治療周期正成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點。目前,許多方法被嘗試用于促進(jìn)牽張成骨過程中新骨和骨痂形成,縮短DO固定期。這些方法包括應(yīng)用脫礦骨基質(zhì)、無機(jī)鹽、低強(qiáng)度超聲、直流電、電磁場刺激、高壓氧、干細(xì)胞和細(xì)胞因子等。雖然上述方法獲得了一定的效果,但這些手段均未獲得廣泛的臨床應(yīng)用。很多生長因子和細(xì)胞因子已被證實促進(jìn)體內(nèi)骨再生,研究最多的是骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)家族,在不同動物模型上都表明可以促進(jìn)牽張間隙異位成骨,其中BMP-2和BMP-7已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于骨不連的病人。其他誘導(dǎo)骨生長和分化細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-betal, TGF-β1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic f ibroblastgrowth factor, bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growthfactor-1,IGF-1)等也對新骨生成有一定促進(jìn)作用。但這些外源性應(yīng)用的生長因子數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理劑量才能發(fā)揮成骨的作用,可能與其半衰期短和導(dǎo)入途徑有關(guān)。此外,細(xì)胞因子超生理劑量的應(yīng)用不僅費(fèi)用高昂,限制了臨床廣泛的應(yīng)用,而且導(dǎo)致臨近的非骨組織異位成骨。鑒于這些并發(fā)癥,基于生長因子過表達(dá)策略的基因治療成為促進(jìn)成骨的一種新的策略。 以BMP-2、BMP-7和bBGF為目的基因的基因治療已用于實驗動物并成功的促進(jìn)牽張成骨新骨形成。但是這種使骨生長因子過表達(dá)的基因治療策略,對周圍非骨組織的旁分泌導(dǎo)致的復(fù)雜的釋放動力學(xué)和無法調(diào)控的異位成骨阻礙了這一方法在臨床的應(yīng)用。此外,牽張成骨中新骨形成是一個非常復(fù)雜的過程,是多因素、多細(xì)胞因子共同參與的過程,而讓多種生長因子同時高表達(dá)有一定困難。 因此,我們設(shè)想了從眾多生長因子、細(xì)胞因子和動力傳導(dǎo)的中樞和靶向,即轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的水平尋找牽張成骨基因治療的一種新方法,以避免基于骨生長因子基因治療的一些弊端。 轉(zhuǎn)錄因子,包括Runx2, Smads, Dlx-3, Dlx-5, MSX-2, AP-1和Osterix(OSX)都在骨愈合過程中表達(dá),但在這些成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子中,Runx2和Osterix是多潛能骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的必不可少的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Runx2屬于runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族,在成骨部位高表達(dá),在骨形成中發(fā)揮著重要作用。Runx2過表達(dá)在成骨早期能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,但可能抑制成骨細(xì)胞的晚期分化。OSX是一種具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,位于Runx2的下游,OSX的過表達(dá)能誘導(dǎo)有成骨潛能的細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,補(bǔ)充成骨細(xì)胞來源,抑制軟骨細(xì)胞形成,促進(jìn)新骨的成熟和礦化,避免了Runx2抑制成骨細(xì)胞的晚期分化的問題。而國際上也尚未查見關(guān)于OSX基因治療用于牽張成骨的報道。 因此,在本研究中選擇OSX為目的基因,首先建立兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動物模型,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組質(zhì)粒pEGFP-OSX瞬時轉(zhuǎn)染MSCs,將OSX修飾的MSCs導(dǎo)入到兔下頜牽張間隙中；應(yīng)用影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計量學(xué)等手段與對照組比較,評價OSX局部基因治療對牽張成骨中新骨的形成和礦化的作用,并檢測BSP體內(nèi)表達(dá)情況。本研究結(jié)果將為OSX基因治療策略促進(jìn)牽張成骨新骨形成和縮短牽張成骨療程提供科學(xué)的實驗依據(jù),為最終的臨床應(yīng)用 1.兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動物模型的建立：選擇新西蘭大白兔為實驗動物,4～5個月齡,3.0～3.5 kg,雌雄不限。使用改進(jìn)的內(nèi)置式牽張器,由螺旋牽張桿、導(dǎo)向滑動桿、固定臂、旋轉(zhuǎn)柄以及連結(jié)旋轉(zhuǎn)柄的方向關(guān)節(jié)等組成,每旋轉(zhuǎn)一圈,牽張距離為0.4mm.用戊巴比妥鈉在兔耳緣靜脈注射麻醉后,在下切牙與后牙之間約1公分的區(qū)域內(nèi)選擇截骨部位,骨切開后用4個鈦螺釘固定牽張成骨器。6天的延遲期后,進(jìn)行牽張,速度為0.8mm／天(上午8：00.,4mm,下午8：0,0.4mm),連續(xù)10天,共牽張延長8mm,牽張結(jié)束后固定牽張器。分別于固定期開始的第2、6周處死一半動物。動物處死后下頜骨標(biāo)本行X線檢查和組織學(xué)HE染色觀察。 2. pEGFP-OSX的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增獲得目的基因,經(jīng)過純化、酶切、酶切產(chǎn)物回收與純化制備目的基因。載體進(jìn)行酶切消化后將酶切產(chǎn)物回收、純化,使載體線性化。然后將獲得的目的基因連接到載體,制備感受態(tài)、轉(zhuǎn)化,將構(gòu)建的新質(zhì)粒PCR擴(kuò)增,測序鑒定。 3.兔自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)和傳代,采用密度梯度離心法,取生長良好第3代細(xì)胞用于基因轉(zhuǎn)染和治療。 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染MSCs和基因治療：取與每只兔相對應(yīng)的第3代骨髓MSCs,消化計數(shù),并傳代至6孔板內(nèi),用以作基因轉(zhuǎn)染。細(xì)胞傳代24h后,細(xì)胞達(dá)到80%融合,此時采用脂質(zhì)體法進(jìn)行pEGFP-OSX:基因轉(zhuǎn)染操作,通過熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率來觀察轉(zhuǎn)染后OSX基因的表達(dá)。分別用pEGFP-OSX修飾的MSCs(A組,18只),MSCs(B組,18只)和生理鹽水(C組,18只),在牽張結(jié)束后立即對兔牽張間隙多點注射治療。 5.成骨效果檢測：于牽張結(jié)束第2周和第6周隨機(jī)處死各9只動物,標(biāo)本獲取后立即行X線檢查,然后檢測牽張區(qū)骨密度。每個標(biāo)本制作不連續(xù)切片16張,10張用以HE染色,在光鏡下觀察并進(jìn)行形態(tài)計量學(xué)分析；6張用以免疫組織化學(xué)檢測骨涎蛋白(BSP)表達(dá)。骨組織形態(tài)計量學(xué)采用圖像分析軟件進(jìn)行分析。每一標(biāo)本均測量10張不連續(xù)切片,測量結(jié)果的均數(shù),為該標(biāo)本的測量參數(shù)值。測量參數(shù)包括新生骨量和新生骨小梁厚度。 6.統(tǒng)計學(xué)分析：實驗中牽張間隙骨密度、骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差來表示。對每一時間點各指標(biāo)的組間差異應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0進(jìn)行單因素的方差分析。P＜0.05差異具有顯著性。 1.活體觀察實驗動物,均耐受手術(shù)及術(shù)后牽張,飲食大小便正常,牽張結(jié)束后存在偏頜現(xiàn)象。大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)牽張側(cè)下頜骨延長。標(biāo)本X線檢查和組織學(xué)觀察證實動物模型牽張間隙成骨良好,下頜骨按照預(yù)定目標(biāo)延長。 2.通過基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,測序分析證實了pEGFP-OSX質(zhì)粒的正確性。 3.應(yīng)用密度梯度離心法成功分離兔骨髓MSCs,脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX瞬時轉(zhuǎn)染骨髓MSCs,熒光顯微鏡下觀察48小時的轉(zhuǎn)染效率為40-45%。 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,OSX基因修飾的自體骨髓MSCs治療組(A組)比MSCs治療組(B組)顯示出更好的成骨和礦化,自體骨髓MSCs治療組也比生理鹽水注射組(C組)表現(xiàn)出更好的骨痂形成。骨密度和組織形態(tài)計量學(xué)檢測后,統(tǒng)計分析結(jié)果與上述一致,A組顯著優(yōu)于B組(P0.05),B組顯著優(yōu)于C組(P0.05)。 5.免疫組織化學(xué)檢測表明在牽張結(jié)束第2周時A組中多數(shù)間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和新生的骨基質(zhì)均有BSP強(qiáng)染色,B組BSP染色較淺,C組染色最淺。 1.內(nèi)置式牽張器能夠滿足兔單側(cè)下頜骨延長的要求,牽張成骨的延遲期成骨與骨折愈合過程類似,但是牽張期和固定期骨再生具有特征性的組織學(xué)變化。 2.本實驗成功建立了穩(wěn)定的兔單側(cè)下頜骨牽張成骨的動物模型,重復(fù)性高,適合大批量動物實驗,為細(xì)胞和基因治療提供了良好的實驗平臺。 3.密度梯度離心法所獲MSCs具有很強(qiáng)的體外增值活性,是進(jìn)行細(xì)胞治療和基因治療的理想種子細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察,脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染可以使pEGFP-OSX基因在MSCs中成功表達(dá),但轉(zhuǎn)染效率很低。 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察都證實,與單純MSCs及生理鹽水比較,pEGFP-OSX修飾的MSCs可更有效促進(jìn)兔下頜牽張成骨過程中新骨形成和礦化,提示OSX基因治療是促進(jìn)下頜骨牽張成骨行之有效的手段。 5.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明,OSX基因治療提高了成骨標(biāo)志性蛋白-BSP的表達(dá)水平,進(jìn)一步提示OSX基因修飾的MSCs在體內(nèi)發(fā)揮了促進(jìn)新骨形成和礦化的作用。 6.應(yīng)用OSX基因體外轉(zhuǎn)染MSCs進(jìn)行基因治療的方法,能夠促進(jìn)牽張成骨中骨再生和縮短治療周期,為牽張成骨臨床治療提供了一個新的策略。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R782
【部分圖文】：

防肥胖癥的發(fā)生進(jìn)行分析。將雌性大鼠治療組和對照組中的體重一時間作曲線，其結(jié)果見圖2。雄性大鼠的體重一時間作曲線見圖3�？梢钥闯�，經(jīng)異種小鼠前脂肪細(xì)胞免疫后的大鼠，不論雌性和雄性，體重都得到明顯的抑制，統(tǒng)計學(xué)分析P<0.05。而人成纖維細(xì)胞系MRC一5、 NIH/3T3細(xì)胞和0.9%生理鹽水免疫后的大鼠.，體重沒有明顯變化，統(tǒng)計學(xué)分析P>0.05。(3)大鼠的脂肪細(xì)胞中自身抗體儲存的檢測通過用異種前脂肪細(xì)胞免疫大鼠的血清和未被異種前脂肪細(xì)胞免疫大鼠的血清(作對照)作為第一抗體的免疫組織化學(xué)技術(shù)染色免疫大鼠的前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞，可以鑒定出在被免疫大鼠的前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中有自身抗體儲存。實驗方法1.石蠟切片常規(guī)脫蠟至水2.3%雙氧水室溫孵育10min3.PBS沖洗，smin*3次4.滴加提前配好的一抗(小鼠血清)，4℃過夜5.PBS沖洗，smin*3次6.滴加二抗(濃度loug/ml)
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高曉燕;金葡液在兔下頜骨牽張成骨中作用的研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2011年

2 柳星光;依普拉芬在兔下頜骨牽張成骨中作用的研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2012年

本文編號：2884937