目的:明確DNCP微環(huán)境下小鼠iPS細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的效果及探討B(tài)MPs對誘導(dǎo)分化過程的影響及可能機(jī)制。方法:實驗第一部分:將購買的小鼠iPS(OSKM體系)復(fù)蘇、與小鼠MEF共培養(yǎng)環(huán)境下用iPS細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增、傳代,繼而用iPS細(xì)胞分化培養(yǎng)基懸滴培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入低黏附培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)制備擬胚體。用倒置顯微鏡觀察iPS克隆團(tuán)的形態(tài)特點和擬胚體的形成過程。懸浮培養(yǎng)2d免疫熒光法檢測擬胚體多能干細(xì)胞標(biāo)志性基因Oct-4、Sox-2的表達(dá)。實驗第二部分:從小鼠離體牙中提取DNCP,采用MTT法確定DNCP最佳作用濃度,各組實驗濃度設(shè)定為100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml。收集擬胚體,參照MTT實驗結(jié)果設(shè)計四組:自分化對照組、添加500ng/ml的DNCP、添加500ng/mlDNCP+50ng/ml的Noggin、添加500ng/mlDNCP+25ng/ml BMP-2+25ng/ml BMP-4四組定向分化,連續(xù)培養(yǎng)10d,運用qRT-PCR檢測各組成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物DMP-1、DSPP及相關(guān)通路基因Msx-1表達(dá)。運用Western-blot檢測各組p38和Smad-4蛋白表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果:共培養(yǎng)環(huán)境下小鼠iPS細(xì)胞克隆團(tuán)樣生長,克隆團(tuán)呈小的球形,細(xì)胞形態(tài)較一致,排列緊密。懸滴培養(yǎng)3d和懸浮培養(yǎng)2d形成擬胚體的散在分布,形態(tài)均一,體積較大,實性型,可見細(xì)胞多形性。第5d擬胚體免疫熒光實驗顯示Oct-4和Sox-2陽性表達(dá)。MTT結(jié)果示500ng/mlDNCP處理組小鼠iPS細(xì)胞具有最佳的存活率和增殖能力。QRT-PCR結(jié)果:經(jīng)DNCP誘導(dǎo)10d后,小鼠iPS細(xì)胞陽性表達(dá)DSPP、DMP-1,添加Noggin后,DSPP、DMP-1表達(dá)相較于DNCP組減少(P0.05)。若在DNCP組的基礎(chǔ)上添加外源性BMPs,DSPP、DMP-1表達(dá)明顯增加(P0.05)。各組Msx-1基因的表達(dá)趨勢與DSPP、DMP-1表達(dá)相同。Western blot顯示:DNCP組相較于空白對照組p38/p-p38和Smad4/p-Smad4的表達(dá)均有所增加(P0.05)。在DNCP組的基礎(chǔ)上添加Noggin,兩類通路蛋白并未明顯增加。若改為添加BMPs混合液,p38和Smad4表達(dá)相較與DNCP組有明顯增加,(P0.05),且及兩者的活化水平亦相應(yīng)增加(P0.05)。結(jié)論:500ng/mL的DNCP微環(huán)境可誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化。BMP/Smad和BMP/p38信號通路在其中發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

貼壁后用 4%多聚甲醛固定 15～20 分鐘；②PBS 浸泡洗，10min×3 次；③0.riton X-100 破膜 10min，PBS 浸泡洗，10min×4 次。④一抗工作液（用 2% B稀釋比例為 1:200 稀釋抗體），4℃孵育過夜。次日室溫平衡 30min，PBS洗，10min×4 次；⑤二抗工作液（用 2% PBS 以稀釋比例為 1:1000 稀釋）37育 60min，1×PBS 浸泡洗，10min×4 次；⑥D(zhuǎn)API 復(fù)染 5min，PBS 浸泡洗0min×3 次；⑦晾干封片，拍照。.3 實驗結(jié)果.3.1 誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察大約第 5 天共培養(yǎng)集落出現(xiàn) iPS 細(xì)胞克隆團(tuán)，周圍由梭性 MEF 包繞。鏡期克隆團(tuán)呈不規(guī)則球形細(xì)胞，較小，邊界清楚。細(xì)胞簇內(nèi)細(xì)胞高度同質(zhì)化構(gòu)致密，核漿比高，核仁明顯。彼此排列緊密，細(xì)胞界限不清。

圖 1.2 擬胚體形成結(jié)果，圖中標(biāo)尺為 10 μm免疫熒光結(jié)果對懸浮生長在分化培養(yǎng)基的 2d 的小鼠 iPS 細(xì)胞多能性基因 Oct-4、Sox-2鑒定，兩者均呈陽性表達(dá)。說明 iPS 細(xì)胞形成擬胚體初期仍具有具有良好的性。.3.3

小鼠iPS細(xì)胞擬胚體全能性基因免疫熒光化學(xué)分析，圖中標(biāo)尺為20μm
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5 梅麗琴,石四箴;牙本質(zhì)形成的研究進(jìn)展[J];上海醫(yī)學(xué);2004年07期

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7 龐宇軒;尹碩;張娟;李江;;第三期牙本質(zhì)形成的機(jī)理與調(diào)控[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2016年01期

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9 謝曉華;趙芳;王麗杰;劉培紅;王海俠;馬肅;王秀梅;;骨涎蛋白在大鼠磨牙第三期牙本質(zhì)形成過程中的表達(dá)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年28期

10 朱平,張秀麗,張偉國;大鼠牙齒發(fā)育過程中牙本質(zhì)形成的超微結(jié)構(gòu)[J];解剖學(xué)雜志;2001年03期

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本文編號：2880439