目的： (1)探討TBK1和IKKi在人舌癌細(xì)胞增殖中的作用,為靶向抑制TBK1和IKKi治療舌癌奠定理論基礎(chǔ)。 (2)驗(yàn)證新型化合物對(duì)TBK1和IKKi的抑制能力并評(píng)價(jià)其體外抗舌癌活性。 (3)闡釋TBK1和IKKi雙重抑制化合物對(duì)舌癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用,及其相關(guān)機(jī)制。 (4)觀察TBK1和IKKi雙重抑制化合物在舌癌荷瘤裸鼠治療效果,探討其抑瘤作用及其發(fā)生機(jī)制,為其在舌癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： (1)常規(guī)培養(yǎng)人舌癌細(xì)胞株SCC-9, SCC-15, SCC-25, Western blotting檢測(cè)TBK1和IKKi及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況,采用siRNA干擾技術(shù)分別抑制TBK1或/和IKKi后檢測(cè)舌癌細(xì)胞增殖水平。 (2)檢測(cè)LPS刺激下鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的IRF-3活化水平對(duì)化合物的TBK1和IKKi抑制能力進(jìn)行評(píng)估,并采用MTT法測(cè)定化合物作用下的舌癌細(xì)胞株增殖水平。 (3)使用ApopTag原位凋亡檢測(cè)試劑盒觀察舌癌細(xì)胞在化合物200A作用下的凋亡現(xiàn)象,Western blotting對(duì)化合物200A誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行分析,并探討凋亡機(jī)制。 (4)建立SCC-9舌癌荷瘤裸鼠模型,應(yīng)用TBK1和IKKi雙重抑制化合物200A進(jìn)行治療,觀察其對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng),采用免疫組化、Western blotting、RT-PCR分析化合物200A治療前后腫瘤組織的VEGF, p-AKT表達(dá)。 結(jié)果： (1)三種舌癌細(xì)胞株中均可以檢測(cè)到TBK1和IKKi及其磷酸化表達(dá),p-IKKi的表達(dá)水平高于p-TBK1。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,TBK1-siRNA, IKKi-siRNA SCC-25兩組細(xì)胞的增殖水平略有下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但在SCC-25的TBK1和IKKi均被抑制后其增殖水平被顯著抑制,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 (2) Western blotting發(fā)現(xiàn)三種化合物均能下調(diào)LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞中IRF-3的磷酸化水平,其中200A作用相對(duì)較強(qiáng)。MTT法發(fā)現(xiàn)三種化合物對(duì)三種舌癌細(xì)胞株均具有較好的抑制作用(IC50介于0.430-1.901μM),其中200A在這三種舌癌細(xì)胞株中具有均衡的、較低的IC50,表現(xiàn)出較高的抗舌癌細(xì)胞增殖活性。 (3)形態(tài)學(xué)研究證實(shí)TBK1和IKKi雙重抑制化合物可以促進(jìn)舌癌細(xì)胞凋亡,隨著化合物處理時(shí)間增長(zhǎng)或化合物濃度增高,Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7及Cleaved PARP蛋白表達(dá)水平逐漸增高。舌癌細(xì)胞在TBK1和IKKi雙重抑制化合物處理后,CyclinD1、p-AKT、p-CYLD蛋白表達(dá)水平下降。 (4)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨著200A腹腔注射時(shí)間增長(zhǎng),其對(duì)實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果逐漸加強(qiáng)(圖5-1)。從第22天起,兩組之間腫瘤體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),到第31天及之后,兩組之間腫瘤體積差異具有更顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。治療過(guò)程中,裸鼠精神狀態(tài)佳,生長(zhǎng)發(fā)育、飲食活動(dòng)均未見(jiàn)明顯異常,表明化合物200A毒性反應(yīng)小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組的腫瘤重量小于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),瘤重抑制率為56.97%。免疫組化結(jié)果顯示VEGF及p-AKT在實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),RT-PCR和Western blotting分別驗(yàn)證了該結(jié)果。 結(jié)論： (1)TBK1和IKKi在舌癌細(xì)胞中表達(dá)并活化,IKKi的磷酸化水平高于TBK1,同時(shí)抑制它們可有效抑制舌癌細(xì)胞的增殖,表明TBK1和IKKi可成為新型抗舌癌藥物的分子靶點(diǎn)。 (2)TBK1和IKKi雙重抑制化合物SR8185、200A和200B具有抑制TBK1和IKKi勺能力,且可抑制舌癌細(xì)胞增殖,尤以200A相對(duì)最佳,可作為新型抗舌癌藥物的候選化合物。 (3)TBK1和IKKi雙重抑制化合物具有抗舌癌作用,一方面細(xì)胞水平可呈時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖,其機(jī)制可能與下調(diào)舌癌細(xì)胞Cyclin D1、p-AKT、p-CYLD的蛋白表達(dá)有關(guān)；另一方面機(jī)體水平抑制舌癌荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng),無(wú)明顯毒、副作用,可能因?yàn)橐种艫KT活化,下調(diào)VEGF表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤血管生成,發(fā)揮其抗腫瘤作用。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R739.86
【部分圖文】：

三種舌癌細(xì)胞株SCC-9，SCC-15, SCC-25常規(guī)培養(yǎng)后提取蛋白，Westernblotting檢測(cè)TBK1、p-TBKl、IKKi、p-IKKi的蛋白表達(dá)水平（圖1-1)。結(jié)果顯示TBK1和IKKi在舌癌的細(xì)胞中均有表達(dá),IKKi的磷酸化水平比較高，但TBK1的憐酸化水平比較低，但亦可檢測(cè)到，這三種舌癌細(xì)胞中IKKi的活化水平高于TBK1。雇國(guó)^ P-IKKi1I^HIHp"--mmr P -T B K 1P-actin士圖1-1舌癌細(xì)胞中p-IKKi, IKKi, p-TBKl,TBKl的蛋白表達(dá)水平FigureI-1 Western blotting analysis of the expression of p-IKKi, IKKi, p-TBKl, TBKl inindicated cell lines.1.3.2人舌癌細(xì)胞SCC-25中siRNA抑制IKKi表達(dá)后對(duì)TBKl和p-TBKl的蛋白表達(dá)的影響采用siRNA技術(shù)抑制SCC-25細(xì)胞IKKi表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IKKi表達(dá)沉默能明顯上調(diào)TBK1與P-TBK1蛋白的表達(dá)（圖1-2)。14

SCC-25細(xì)胞和對(duì)照組的IKKi, p-TBKl, TBK1的蛋ern blotting analysis of the expression of IKKi，p-TBKl,transfected with scrambled or IKKi-siRNA for 72 hSCC-25中siRNA抑制TBKI或/和IKKi之SCC-25采用siRNA抑制TBK1或/和IKKiKi-siRNA 及 TBKl&IKKi-siRNA SCC-25 四組3，5天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)見(jiàn)表]-1，繪制3天時(shí)，各組細(xì)胞增殖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)TBKl-siRNA, IKKi-siRNA SCC-25兩組細(xì)胞，但他們?nèi)M之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>純抑制TBK1或IKKi時(shí)，其細(xì)胞増殖A SCC-25組細(xì)胞增殖水平低于其它三組，認(rèn)為在SCC-25細(xì)胞中TBK1和IKKi均被抑

圖1-3 SCC-25細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖中所示的siRNA后的細(xì)胞增殖水平（J土?？，n=3 )(**/"<0.0丨差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA干擾效率采用Western blotting驗(yàn)證）igure 1-3 Cell proliferation analysis of SCC-25 cells transfected with indicated siRNAs(X n=3)
【參考文獻(xiàn)】

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1 張宇清,朱運(yùn)松;干擾素調(diào)節(jié)因子-3的分子結(jié)構(gòu)和磷酸化[J];生命的化學(xué);2003年04期

本文編號(hào)：2876941