發(fā)布時間：2020-11-09 17:59

　　 牙周炎是由菌斑生物膜引起的牙周組織的感染性疾病,能夠?qū)е逻M(jìn)行性的附著喪失,牙周袋的形成及牙槽骨吸收,是成年人失牙的主要原因。牙周膜成纖維細(xì)胞作為牙周膜中的主體細(xì)胞,在牙周組織的病變,修復(fù)及再生過程中發(fā)揮了重要作用,培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞建立體外模型,是研究牙周組織疾病的重要手段之一。牙齦卟啉單胞菌為慢性牙周病的主要致病菌,脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是其細(xì)菌外膜的主要成分,是重要的炎癥啟動因子。LPS能夠通過破壞牙齦結(jié)合上皮進(jìn)入牙周組織,被Toll樣受體識別,誘導(dǎo)牙周膜成纖維細(xì)胞釋放出IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-a,IL-10等多種炎癥相關(guān)因子,加重牙周組織的炎癥反應(yīng),是導(dǎo)致牙周組織破壞的重要毒力因子。Toll樣受體是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子,通過識別病原相關(guān)分子模式,引起細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路,激活靶基因,釋放炎癥因子,啟動炎癥反應(yīng)。Toll樣受體家族中的不同Toll樣受體可以識別不同的配體,其中TLR-2及TLR-4主要參與了LPS的識別及信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在LPS誘導(dǎo)下的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。一氧化碳為一種重要的氣體信號分子,在機(jī)體組織和細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)揮抗炎及抗凋亡的作用。一氧化碳釋放分子是一種由過渡金屬組成的新型金屬-碳基化合物,已被證實可在特定條件下緩慢釋放一定量的CO并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。前期研究已發(fā)現(xiàn),CORM-3對于炎性因子誘導(dǎo)下人牙齦成纖維細(xì)胞粘附分子的表達(dá)具有抑制作用,抑制了免疫細(xì)胞向牙周組織的粘附、浸潤和遷移,繼而減輕宿主的炎性病理反應(yīng)。提示我們應(yīng)用CORM-3治療牙周炎的可行性�；谝陨媳尘�,本實驗通過檢測CORM-3對LPS誘導(dǎo)下牙周膜成纖維細(xì)胞IL-6,IL-8,IL-10的分泌,TLR2,TLR4mRNA及蛋白的表達(dá)的影響,初步探討CORM-3對脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響。材料和方法第一部分人牙周膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定于山東大學(xué)口腔醫(yī)院,收集15-25歲正畸志愿者牙周和牙體均健康的新鮮拔出的前磨牙或智齒,無菌條件下刮取根中1/3的牙周膜組織,組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞,酶消法進(jìn)行傳代。取原代培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligamentcells,hPDLC)及培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞,于倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)和特征。采用免疫組織化學(xué)染色法,通過波形蛋白和角形蛋白染色對其鑒定細(xì)胞來源。第二部分CORM-3對LPS誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子釋放的影響研究培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(同第一部分),取第4~6代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組,LPS組,LPS+CORM-3 100μM組,LPS+CORM-3 200μM組,LPS+CORM-3 400μM 組�？瞻捉M不加任何刺激。LPS組以 10μg/mL p.g.LPS 刺激細(xì)胞24h,LPS+CORM-3 各組先分別以CORM-3(100μM,20(μM,400μM)預(yù)處理細(xì)胞24h后,再加入 1Oμg/mL p.g.LPS刺激24h,收集細(xì)胞上清液,ELISA法檢測各組上清液中IL-6,IL-8,IL-10等因子的表達(dá)。第三部分CORM-3對LPS誘導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞TLR-2和TLR-4表達(dá)的影響研究培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(同第一部分),取第4～6代生長良好的細(xì)胞用于實驗。隨機(jī)分為空白對照組,LPS組,LPS+CORM-3組,LPS+失活CORM-3組及CORM-3組,空白組不加任何刺激。LPS組以10μg/mLp.g.LPS刺激24h,LPS+C0RM-3組先以400μM C0RM-3預(yù)處理24h后,再加入10μg/mL p.g.LPS刺激24h,LPS+失活CORM-3組以完全釋放掉CO的失活的CORM-3預(yù)處理細(xì)胞24h,再加入10μg/mL p.g.LPS刺激24后,提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行實時定量PCR方法檢測TLR-2,TLR-4的mRNA表達(dá);收集細(xì)胞,以流式細(xì)胞技術(shù)檢測TLR-2,TLR-4的蛋白的表達(dá)。結(jié)果第一部分 人牙周膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞呈長梭形,有長短不等的細(xì)胞突起,胞核呈卵圓形或圓形,符合成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征。培養(yǎng)至第4代的細(xì)胞形態(tài)仍保持不變,生長速度較快。免疫組織化學(xué)染色顯示:細(xì)胞抗波絲蛋白染色呈陽性,抗角蛋白染色呈陰性,證明細(xì)胞來源于中胚層。第二部分CORM-3能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子釋放ELISA結(jié)果顯示:1Oμg/mL p.g.LPS刺激后,hPDLCs分泌的IL-6、IL-8及IL-10的量較空白對照組均有明顯增高(p0.05)。以CORM-3預(yù)處理后的各組細(xì)胞,IL-6、IL-8的表達(dá)較LPS組比較均出現(xiàn)顯著下降(p0.05),上清液中IL-10的分泌較LPS有顯著上調(diào)(P0.05),并呈濃度依賴性。LPS+400μM CORM-3組IL-6、IL-8表達(dá)下調(diào)作用最為顯著,同時,該組的IL-I0表達(dá)上調(diào)作用也最為顯著(P0.05)。第三部分CORM-3能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞TLR-2和TLR-4表達(dá)實時定量PCR結(jié)果顯示:10μg/mLp.g.LPS刺激后,hPDLCs TLR-2mRNA的表達(dá)約為空白對照組的2倍(p0.05),TLR-4 mRNA表達(dá)約為空白對照組1.2倍(p0.05),以CORM-3預(yù)處理后的各組細(xì)胞,TLR-2、TLR-4 mRNA的表達(dá)較LPS組比較均出現(xiàn)顯著下降(p0.05),LPS+失活CORM-3組較LPS組各基因表達(dá)無明顯差異。CORM-3組較空白對照組各基因表達(dá)無顯著差異。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示:10μg/mL p.g.LPS刺激后,HPDLCs TLR-2表面抗原表達(dá)為空白對照組的2.5倍(p0.05),TLR-4表面抗原表達(dá)為空白對照組2倍(p0.05),以CORM-3預(yù)處理后的各組細(xì)胞,TLR-2、TLR-4表面抗原表達(dá)較LPS組比較均出現(xiàn)顯著下降(p0.05)。LPS+失活CORM-3組較LPS組各表面抗原表達(dá)無顯著差異。CORM-3組較空白對照組各表面抗原表達(dá)無明顯差異。結(jié)論1、組織塊法培養(yǎng)hPDLCs 一般游出時間為7-14天,結(jié)合免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,說明培養(yǎng)的hPDLCs來源可靠,細(xì)胞純度高。2、LPS刺激后,hPDLCs中IL-6,IL-8,IL-10等細(xì)胞因子的分泌顯著增強(qiáng)。CORM-3對LPS誘導(dǎo)的hPDLCs中IL-6,IL-8等炎癥因子的分泌有顯著抑制作用,并對抗炎因子IL-10有顯著上調(diào)作用,且伴有一定的濃度依賴性。3、LPS刺激后,hPDLCs中TLR-2,TLR-4的表達(dá)明顯升高,400μMCORM-3能夠顯著的抑制LPS誘導(dǎo)的hPDLCs中TLR-2,TLR-4的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

鏡下可觀察到，少量細(xì)胞從組織塊邊緣游出，細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀生長，??細(xì)胞多呈長梭形或星形，一般有２－４個胞突，胞核呈卵圓形或圓形，位于胞質(zhì)中??心，與成纖維樣細(xì)胞形態(tài)相似（圖１）。一般細(xì)胞從組織塊游出到長滿瓶底８０％??需要１４－２０ｄ，繼而傳代，貼壁后細(xì)胞增值速度加快，一般４－５ｄ細(xì)胞密度即可達(dá)??到瓶底的８０％，傳代后的細(xì)胞仍保持成纖維樣細(xì)胞的狀態(tài)，長滿單層后呈放射狀??或旋渦狀排列（圖２），本實驗選取４－６代人牙周膜成纖維細(xì)胞用于后續(xù)實驗。??圖１組織塊培養(yǎng)法第８天（２００ｘ）：長梭形細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀生長??．．．塗??圖２傳代培養(yǎng)第４代第５天（２００ｘ）：細(xì)胞長滿單層后呈放射狀或旋渦狀排列??１６??

需要１４－２０ｄ，繼而傳代，貼壁后細(xì)胞增值速度加快，一般４－５ｄ細(xì)胞密度即可達(dá)??到瓶底的８０％，傳代后的細(xì)胞仍保持成纖維樣細(xì)胞的狀態(tài)，長滿單層后呈放射狀??或旋渦狀排列（圖２），本實驗選�。矗洞搜乐苣こ衫w維細(xì)胞用于后續(xù)實驗。??圖１組織塊培養(yǎng)法第８天（２００ｘ）：長梭形細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀生長??．．．塗??圖２傳代培養(yǎng)第４代第５天（２００ｘ）：細(xì)胞長滿單層后呈放射狀或旋渦狀排列??１６??

細(xì)胞抗波絲蛋白陽性(200x)
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本文編號：2876785