目的:牙周病是呼吸道感染疾病的風險因素之一。國內(nèi)外研究顯示牙周病與肺部感染性疾病之間密切相關(guān),牙周袋內(nèi)的致病菌可以導致老年體弱者或長期住院患者發(fā)生肺部感染甚至肺膿腫。在對美國國民健康調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隨著牙周附著喪失的增加,肺功能表現(xiàn)出降低的趨勢,此外,牙菌斑的形成可導致厭氧菌的滋生,并通過一系列內(nèi)在機制導致嗜酸性粒細胞的募集與激活,而肺部疾病也被看作是慢性嗜酸性粒細胞炎癥障礙性疾病之一,因此從疾病的發(fā)病機制來講,牙周病與肺部疾病具有相似之處。P.gingivalis(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在引發(fā)牙周組織破壞過程中發(fā)揮著重要的作用,能分泌大量的毒力因子,導致牙周組織破壞,是公認的牙周致病菌。P.gingivalis的主要致病物質(zhì)包括菌毛、纖毛、外膜、莢膜等菌體成分,以及產(chǎn)生的內(nèi)毒素、蛋白酶等毒力因子。研究表明,P.gingivalis侵入宿主細胞后,其菌毛迅速黏附在宿主細胞表面,通過與定位于脂質(zhì)筏的細胞表面受體相互作用內(nèi)吞入胞,導致細胞自噬的發(fā)生,自身于胞內(nèi)自噬體中復制增殖。大量復制的P.gingivalis釋放于胞外,其致病物質(zhì)通過激活Toll樣受體和Nod樣受體,產(chǎn)生IL-1、TNF-α等促炎因子,從而激發(fā)宿主的固有免疫機制。由于慢性牙周炎的早期癥狀不易引起重視,繼而造成牙周組織長期慢性感染,炎癥反復發(fā)作,不僅損害口腔咀嚼系統(tǒng)的功能,而且與多種系統(tǒng)性疾病相關(guān),近年的研究表明牙周病與呼吸系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系,由于口咽與呼吸系統(tǒng)直接相通,El-Solh等人研究顯示牙周病與吸入性肺炎、慢性阻塞性肺疾病之間有一定的相關(guān)性。流感病毒是陰性的囊膜RNA病毒,流感病毒的8段RNA基因共編碼13個蛋白:HA和NA是病毒表面的具有抗原性的糖蛋白,和病毒的致病性有直接關(guān)系;脂質(zhì)雙層膜的下面是M1和M2蛋白,M2蛋白是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白。M2蛋白可以通過阻止自噬體的成熟及自噬體和溶酶體的融合而引發(fā)自噬體的形成,而自身可于自噬體內(nèi)復制增殖。自噬作為真核生物的自我防護機制之一,可以選擇性識別和消除入侵病原體。然而有些病原體可以在自噬體的保護下完成其復制,從而顛覆正常的自噬途徑。研究表明,P.gingivalis和H1N1以相似的機制利用自噬途徑進行生長繁殖,即通過抑制自噬體與溶酶體融合或改變正常的自噬轉(zhuǎn)運而抑制自噬體成熟,分解利用自噬體所包裹的蛋白質(zhì)而定植在晚期自噬體內(nèi),造成感染持續(xù)存在。本研究的目的是研究當P.gingivalis和H1N1病毒共同感染肺上皮細胞時,發(fā)生宿主細胞凋亡時,自噬的產(chǎn)生對細胞炎癥因子的作用,及引起的細胞自噬對凋亡的影響,探討混合感染對細胞損傷的可能機制。研究方法:研究對象:P.gingivalis標準株:ATCC 33277,中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔生物學教研室提供。甲型流感病毒模式株:H1N1 PR/8/34,錦州醫(yī)科大學病原微生物教研室提供。呼吸道上皮細胞:A549細胞株(人肺腺癌細胞株,ATCC CCL-185),錦州醫(yī)科大學病原微生物教研室提供。1、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導肺上皮A549細胞凋亡影響首先P.gingivalis和肺上皮A549細胞的體外培養(yǎng),甲型流感病毒H1N1的擴增及滴定;其次P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1混合感染肺上皮A549細胞時,最佳感染復數(shù)的選擇。MOI值分別為10:1、50:1、100:1的P.gingivalis感染肺上皮A549細胞,37℃,5%CO_2條件下共同孵育3h后,分別加入MOI值為1:1、2:1、4:1的甲型流感病毒H1N1,感染肺上皮A549細胞;最后以MTT法及FITC Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測各組A549細胞的存活率及凋亡率。2、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導肺上皮A549細胞相關(guān)炎癥因子的表達應(yīng)用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測感染的肺上皮A549細胞上清液中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的含量變化。3、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導肺上皮A549細胞自噬和凋亡的研究通過熒光顯微鏡、透射電鏡觀察肺上皮A549細胞自噬的發(fā)生,免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II和p62的表達。通過使用3MA抑制肺上皮A549細胞檢測凋亡蛋白caspase-3的表達。4、統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用mean±SD表示,多組比較采用方差分析(兩兩比較應(yīng)用S-N-K法),P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis感染肺上皮A549細胞凋亡的影響。當P.gingivalis MOI值為50:1,甲型流感病毒H1N1 MOI值為2:1時,既可以達到混合感染的最大感染效率又不會造成細胞的大量死亡,可作為后續(xù)研究的混合感染復數(shù)。MTT結(jié)果顯示,單獨病毒H1N1組的存活率明顯低于P.gingivalis+H1N1組(P0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,單獨病毒H1N1組的細胞凋亡率明顯高于P.gingivalis+H1N1組(P0.05)。2、甲型流感病毒H1N1與P.gingivalis共同感染肺上皮A549細胞炎癥因子的表達。與對照組相比,實驗組產(chǎn)生的炎癥細胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的濃度均顯著升高,隨著時間的延長,表達量升高,P0.05;當P.gingivalis MOI值為50:1,隨著流感病毒H1N1量的增加,TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的表達增多,P0.05。3、甲型流感病毒H1N1和P.gingivalis誘導肺上皮A549細胞自噬和凋亡的研究。電鏡檢測P.gingivalis和流感病毒H1N1作用于肺上皮A549細胞后自噬體的形成,熒光顯微鏡結(jié)果顯示P.gingivalis+H1N1組的GFP-LC3表達顯著增加;western blotting檢測各組自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II和p62的表達結(jié)果顯示,12h及24h時間點LC3II/LC3I表達由高到低為:混合感染組單獨流感病毒H1N1組單獨P.gingivalis組對照組,p62的表達則相反。使用自噬抑制劑3MA處理后,結(jié)果顯示LC3II/LC3I比率顯著較低,但caspase-3水平顯著較高(P0.05)。結(jié)論:1、P.gingivalis作為一種牙周致病菌能夠定植于呼吸道上皮細胞,使上皮細胞發(fā)生凋亡壞死,甲型流感病毒H1N1也能夠定植于呼吸道上皮細胞,使肺上皮細胞大面積凋亡壞死。若機體同時感染P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1,在一定感染濃度情況下,則會暫時抑制肺上皮細胞凋亡。2、甲型流感病毒H1N1對P.gingivalis誘導肺上皮A549細胞產(chǎn)生炎癥因子起增強作用。甲型流感病毒H1N1可增加炎癥因子的產(chǎn)生,造成嚴重不可逆的肺部損傷。3、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis可以誘導肺上皮A549細胞產(chǎn)生自噬。使用自噬抑制劑3MA可以明顯抑制P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1誘導的肺上皮A549細胞自噬,并促進凋亡的發(fā)生,提示自噬能夠拮抗凋亡的發(fā)生。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結(jié)果3.1 MTT 法檢測肺上皮細胞 A549 細胞的存活率此部分實驗旨在尋求混合感染時P. gingivalis與流感病毒H1N1搭配的最佳感染復數(shù)，當 P. gingivalis MOI 值為 10:1，混合感染與流感病毒 H1N1 單獨感染之間比較無統(tǒng)計學意義，當 P. gingivalis MOI 值為 100:1 時，混合感染的細胞存活率接近為 0，上述兩個 MOI 值均不適合進行后續(xù)研究。我們發(fā)現(xiàn)當流感病毒 H1N1 MOI值為 2:1、P. gingivalis MOI 值為 50:1 時，既可以達到混合感染的最大感染效率又不會造成細胞的大量死亡，可作為后續(xù)研究的混合感染復數(shù)。

中國醫(yī)科大學博士學位論文同 MOI 值單獨病毒 H1N1 組的比較，P<0.05。3.2 倒置顯微鏡下觀察肺上皮細胞 A549 細胞形態(tài)變化如圖 2 所示，混合感染 12h（圖 2A)后，肺上皮細胞 A549 細胞形態(tài)改變?nèi)缦�，空白對照組細胞之間緊密相連，呈梭型或不規(guī)則型貼壁生長，生長旺盛，輪廓清晰；單獨 P. gingivalis 組細胞以完整的單層細胞存在，大多數(shù)的細胞沒有表現(xiàn)出形態(tài)學上的萎縮、變形和分離；混合感染組出現(xiàn)細胞密度降低，貼壁能力變差；單獨 H1N1組部分細胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等現(xiàn)象�；旌细腥� 24h（圖 3.2B）后，處理組A549 細胞形態(tài)均發(fā)生變圓、脫落、聚集，病毒組及混合組病變更為明顯。

中國醫(yī)科大學博士學位論文細胞。分別計數(shù)四組細胞比例并在不同因素處理組進行比較。各處理組中細胞的比例均小于 5%，12h 時間點各處理組凋亡率均較陰性對照組.000。各處理組兩兩比較凋亡率，各組之間存在顯著性差異，P=0.000，單1N1組>混合感染組>單獨P. gingivalis組。24h時間點各處理組兩兩比較凋.000，單獨病毒 H1N1 組>混合感染組>單獨 P. gingivalis 組（圖 3.3）。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張慧鋒;李妍;白雪;劉珊;;mTOR信號通路及其抑制劑的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年02期

2 ;Effect of Porphyromonas gingivalis PrtC on cytokine expression in ECV304 endothelial cells and its level in subgingival plaques from patients with chronic periodontitis[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年07期

本文編號：2868759