目的:牙周病是呼吸道感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。國(guó)內(nèi)外研究顯示牙周病與肺部感染性疾病之間密切相關(guān),牙周袋內(nèi)的致病菌可以導(dǎo)致老年體弱者或長(zhǎng)期住院患者發(fā)生肺部感染甚至肺膿腫。在對(duì)美國(guó)國(guó)民健康調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隨著牙周附著喪失的增加,肺功能表現(xiàn)出降低的趨勢(shì),此外,牙菌斑的形成可導(dǎo)致厭氧菌的滋生,并通過(guò)一系列內(nèi)在機(jī)制導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞的募集與激活,而肺部疾病也被看作是慢性嗜酸性粒細(xì)胞炎癥障礙性疾病之一,因此從疾病的發(fā)病機(jī)制來(lái)講,牙周病與肺部疾病具有相似之處。P.gingivalis(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在引發(fā)牙周組織破壞過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,能分泌大量的毒力因子,導(dǎo)致牙周組織破壞,是公認(rèn)的牙周致病菌。P.gingivalis的主要致病物質(zhì)包括菌毛、纖毛、外膜、莢膜等菌體成分,以及產(chǎn)生的內(nèi)毒素、蛋白酶等毒力因子。研究表明,P.gingivalis侵入宿主細(xì)胞后,其菌毛迅速黏附在宿主細(xì)胞表面,通過(guò)與定位于脂質(zhì)筏的細(xì)胞表面受體相互作用內(nèi)吞入胞,導(dǎo)致細(xì)胞自噬的發(fā)生,自身于胞內(nèi)自噬體中復(fù)制增殖。大量復(fù)制的P.gingivalis釋放于胞外,其致病物質(zhì)通過(guò)激活Toll樣受體和Nod樣受體,產(chǎn)生IL-1、TNF-α等促炎因子,從而激發(fā)宿主的固有免疫機(jī)制。由于慢性牙周炎的早期癥狀不易引起重視,繼而造成牙周組織長(zhǎng)期慢性感染,炎癥反復(fù)發(fā)作,不僅損害口腔咀嚼系統(tǒng)的功能,而且與多種系統(tǒng)性疾病相關(guān),近年的研究表明牙周病與呼吸系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系,由于口咽與呼吸系統(tǒng)直接相通,El-Solh等人研究顯示牙周病與吸入性肺炎、慢性阻塞性肺疾病之間有一定的相關(guān)性。流感病毒是陰性的囊膜RNA病毒,流感病毒的8段RNA基因共編碼13個(gè)蛋白:HA和NA是病毒表面的具有抗原性的糖蛋白,和病毒的致病性有直接關(guān)系;脂質(zhì)雙層膜的下面是M1和M2蛋白,M2蛋白是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白。M2蛋白可以通過(guò)阻止自噬體的成熟及自噬體和溶酶體的融合而引發(fā)自噬體的形成,而自身可于自噬體內(nèi)復(fù)制增殖。自噬作為真核生物的自我防護(hù)機(jī)制之一,可以選擇性識(shí)別和消除入侵病原體。然而有些病原體可以在自噬體的保護(hù)下完成其復(fù)制,從而顛覆正常的自噬途徑。研究表明,P.gingivalis和H1N1以相似的機(jī)制利用自噬途徑進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,即通過(guò)抑制自噬體與溶酶體融合或改變正常的自噬轉(zhuǎn)運(yùn)而抑制自噬體成熟,分解利用自噬體所包裹的蛋白質(zhì)而定植在晚期自噬體內(nèi),造成感染持續(xù)存在。本研究的目的是研究當(dāng)P.gingivalis和H1N1病毒共同感染肺上皮細(xì)胞時(shí),發(fā)生宿主細(xì)胞凋亡時(shí),自噬的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞炎癥因子的作用,及引起的細(xì)胞自噬對(duì)凋亡的影響,探討混合感染對(duì)細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。研究方法:研究對(duì)象:P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)株:ATCC 33277,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物學(xué)教研室提供。甲型流感病毒模式株:H1N1 PR/8/34,錦州醫(yī)科大學(xué)病原微生物教研室提供。呼吸道上皮細(xì)胞:A549細(xì)胞株(人肺腺癌細(xì)胞株,ATCC CCL-185),錦州醫(yī)科大學(xué)病原微生物教研室提供。1、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞凋亡影響首先P.gingivalis和肺上皮A549細(xì)胞的體外培養(yǎng),甲型流感病毒H1N1的擴(kuò)增及滴定;其次P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1混合感染肺上皮A549細(xì)胞時(shí),最佳感染復(fù)數(shù)的選擇。MOI值分別為10:1、50:1、100:1的P.gingivalis感染肺上皮A549細(xì)胞,37℃,5%CO_2條件下共同孵育3h后,分別加入MOI值為1:1、2:1、4:1的甲型流感病毒H1N1,感染肺上皮A549細(xì)胞;最后以MTT法及FITC Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A549細(xì)胞的存活率及凋亡率。2、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)應(yīng)用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)感染的肺上皮A549細(xì)胞上清液中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的含量變化。3、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞自噬和凋亡的研究通過(guò)熒光顯微鏡、透射電鏡觀察肺上皮A549細(xì)胞自噬的發(fā)生,免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II和p62的表達(dá)。通過(guò)使用3MA抑制肺上皮A549細(xì)胞檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用mean±SD表示,多組比較采用方差分析(兩兩比較應(yīng)用S-N-K法),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis感染肺上皮A549細(xì)胞凋亡的影響。當(dāng)P.gingivalis MOI值為50:1,甲型流感病毒H1N1 MOI值為2:1時(shí),既可以達(dá)到混合感染的最大感染效率又不會(huì)造成細(xì)胞的大量死亡,可作為后續(xù)研究的混合感染復(fù)數(shù)。MTT結(jié)果顯示,單獨(dú)病毒H1N1組的存活率明顯低于P.gingivalis+H1N1組(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,單獨(dú)病毒H1N1組的細(xì)胞凋亡率明顯高于P.gingivalis+H1N1組(P0.05)。2、甲型流感病毒H1N1與P.gingivalis共同感染肺上皮A549細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的濃度均顯著升高,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量升高,P0.05;當(dāng)P.gingivalis MOI值為50:1,隨著流感病毒H1N1量的增加,TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的表達(dá)增多,P0.05。3、甲型流感病毒H1N1和P.gingivalis誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞自噬和凋亡的研究。電鏡檢測(cè)P.gingivalis和流感病毒H1N1作用于肺上皮A549細(xì)胞后自噬體的形成,熒光顯微鏡結(jié)果顯示P.gingivalis+H1N1組的GFP-LC3表達(dá)顯著增加;western blotting檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II和p62的表達(dá)結(jié)果顯示,12h及24h時(shí)間點(diǎn)LC3II/LC3I表達(dá)由高到低為:混合感染組單獨(dú)流感病毒H1N1組單獨(dú)P.gingivalis組對(duì)照組,p62的表達(dá)則相反。使用自噬抑制劑3MA處理后,結(jié)果顯示LC3II/LC3I比率顯著較低,但caspase-3水平顯著較高(P0.05)。結(jié)論:1、P.gingivalis作為一種牙周致病菌能夠定植于呼吸道上皮細(xì)胞,使上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死,甲型流感病毒H1N1也能夠定植于呼吸道上皮細(xì)胞,使肺上皮細(xì)胞大面積凋亡壞死。若機(jī)體同時(shí)感染P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1,在一定感染濃度情況下,則會(huì)暫時(shí)抑制肺上皮細(xì)胞凋亡。2、甲型流感病毒H1N1對(duì)P.gingivalis誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子起增強(qiáng)作用。甲型流感病毒H1N1可增加炎癥因子的產(chǎn)生,造成嚴(yán)重不可逆的肺部損傷。3、甲型流感病毒H1N1聯(lián)合P.gingivalis可以誘導(dǎo)肺上皮A549細(xì)胞產(chǎn)生自噬。使用自噬抑制劑3MA可以明顯抑制P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1誘導(dǎo)的肺上皮A549細(xì)胞自噬,并促進(jìn)凋亡的發(fā)生,提示自噬能夠拮抗凋亡的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 MTT 法檢測(cè)肺上皮細(xì)胞 A549 細(xì)胞的存活率此部分實(shí)驗(yàn)旨在尋求混合感染時(shí)P. gingivalis與流感病毒H1N1搭配的最佳感染復(fù)數(shù)，當(dāng) P. gingivalis MOI 值為 10:1，混合感染與流感病毒 H1N1 單獨(dú)感染之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng) P. gingivalis MOI 值為 100:1 時(shí)，混合感染的細(xì)胞存活率接近為 0，上述兩個(gè) MOI 值均不適合進(jìn)行后續(xù)研究。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)流感病毒 H1N1 MOI值為 2:1、P. gingivalis MOI 值為 50:1 時(shí)，既可以達(dá)到混合感染的最大感染效率又不會(huì)造成細(xì)胞的大量死亡，可作為后續(xù)研究的混合感染復(fù)數(shù)。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文同 MOI 值單獨(dú)病毒 H1N1 組的比較，P<0.05。3.2 倒置顯微鏡下觀察肺上皮細(xì)胞 A549 細(xì)胞形態(tài)變化如圖 2 所示，混合感染 12h（圖 2A)后，肺上皮細(xì)胞 A549 細(xì)胞形態(tài)改變?nèi)缦拢瞻讓?duì)照組細(xì)胞之間緊密相連，呈梭型或不規(guī)則型貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛，輪廓清晰；單獨(dú) P. gingivalis 組細(xì)胞以完整的單層細(xì)胞存在，大多數(shù)的細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的萎縮、變形和分離；混合感染組出現(xiàn)細(xì)胞密度降低，貼壁能力變差；單獨(dú) H1N1組部分細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等現(xiàn)象�；旌细腥� 24h（圖 3.2B）后，處理組A549 細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生變圓、脫落、聚集，病毒組及混合組病變更為明顯。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)四組細(xì)胞比例并在不同因素處理組進(jìn)行比較。各處理組中細(xì)胞的比例均小于 5%，12h 時(shí)間點(diǎn)各處理組凋亡率均較陰性對(duì)照組.000。各處理組兩兩比較凋亡率，各組之間存在顯著性差異，P=0.000，單1N1組>混合感染組>單獨(dú)P. gingivalis組。24h時(shí)間點(diǎn)各處理組兩兩比較凋.000，單獨(dú)病毒 H1N1 組>混合感染組>單獨(dú) P. gingivalis 組（圖 3.3）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張慧鋒;李妍;白雪;劉珊;;mTOR信號(hào)通路及其抑制劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年02期

2 ;Effect of Porphyromonas gingivalis PrtC on cytokine expression in ECV304 endothelial cells and its level in subgingival plaques from patients with chronic periodontitis[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年07期

本文編號(hào)：2868759