細(xì)菌感染引起的牙周炎和種植周圍炎是臨床上較為難治愈的疾病，這可能與某些細(xì)菌可以進(jìn)入宿主細(xì)胞，逃避了體液免疫反應(yīng)以及抗菌藥物(不能進(jìn)入細(xì)胞的藥物)有關(guān)。金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)是引起感染性疾病的常見致病菌，有文獻(xiàn)報(bào)道，SA可以侵入到成骨細(xì)胞內(nèi)或被吞噬細(xì)胞吞噬，引起感染的經(jīng)久不愈和反復(fù)發(fā)作。治療的關(guān)鍵在于選擇一種可以進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)且不影響其功能的抗菌藥物，我們前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)米諾環(huán)素(minocycline，MINO)可以進(jìn)入成骨細(xì)胞內(nèi)，但在細(xì)胞內(nèi)是否能發(fā)揮抗菌作用仍無(wú)相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行研究，初步了解MINO的細(xì)胞內(nèi)抗菌作用，有助于金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)感染治療的合理化用藥，為劉洪臣提出的人工種植牙給藥的假設(shè)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)體外培養(yǎng)獲得大量的成年大鼠牙槽骨成骨細(xì)胞(maturerat alveolar osteoblast，MRAOBs)，然后觀察不同濃度的米諾環(huán)素對(duì)MRAOBs增殖、蛋白合成以及堿性磷酸酶活性的影響，以確定米諾環(huán)素在成骨細(xì)胞內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中較適合的參考濃度，并將其作用于被金黃色葡萄球菌感染的成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞內(nèi)外細(xì)菌的抗菌作用。結(jié)果表明米諾環(huán)素在1～200mg／L的濃度范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響，可顯著促進(jìn)MRAOBs的增殖和蛋白合成(P＜0.01)，1～100mg／L濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加促進(jìn)細(xì)胞增殖和蛋白合成的作用顯著增強(qiáng)，至100mg／L時(shí)達(dá)最大促進(jìn)效應(yīng)，而1～200mg／L的米諾環(huán)素能顯著抑制MRAOBs的ALP活性，隨濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)。因此選擇100mg／L濃度的米諾環(huán)素觀察其在15min、30min、45min、60min時(shí)成骨細(xì)胞內(nèi)的蓄積量，結(jié)果顯示米諾環(huán)素成骨細(xì)胞攝取量無(wú)顯著性差異(P＞＞0.05)，可能已經(jīng)達(dá)到細(xì)胞攝入的飽和狀態(tài)，證明MINO可在成骨細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期保持較高的藥物含量。同時(shí)，用金黃色葡萄球菌感染MRAOBs，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)菌落數(shù)并透射電鏡觀察SA侵入成骨細(xì)胞的情況，結(jié)果顯示以60min侵入最多，其次分別為45、30min。最后，將金黃色葡萄球菌侵襲60min的MRAOBs樣本分成兩部分一部分經(jīng)過(guò)慶大霉素細(xì)胞外完全滅菌后再加入100mg／L的米諾環(huán)素，僅僅觀察米諾環(huán)素細(xì)胞內(nèi)的作用，結(jié)果顯示1～24h可使細(xì)胞內(nèi)SA的數(shù)量減少，24h后基本殺滅細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌；另一部分直接加入100mg／L的米諾環(huán)素，細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)菌隨著米諾環(huán)素作用時(shí)間的延長(zhǎng)同時(shí)逐漸減少，3h細(xì)胞外細(xì)菌基本殺滅，24h后細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌也基本完全殺滅。 綜上所述，一定濃度范圍內(nèi)MINO有促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，蛋白合成和抑制成骨細(xì)胞分化的作用，100mg／L米諾環(huán)素可以作為成骨細(xì)胞內(nèi)外抗SA作用的較為適合的參考濃度，且實(shí)驗(yàn)證明MINO具有成骨細(xì)胞內(nèi)抗SA的作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院博士學(xué)位論文圖3一2熒光強(qiáng)度與米諾環(huán)素含量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線4001一一一350}愈目。月。呂。。s。臺(tái)ln山 500100015002000 Standardconcentrationofminocyeline(ng/ml)圖3一3光密度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線03025 0.2 00.15O 0.1Y二0.0025X+0.0002 20406080100 standardconeentrationofProtein(林g/ml)25001202.1.2成骨細(xì)胞內(nèi)米諾環(huán)素含量(樣本測(cè)定)在本實(shí)驗(yàn)測(cè)試條件下用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度，并按回歸方程計(jì)算出米諾環(huán)素濃度;在595nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)得的成骨細(xì)胞的蛋白含量的光吸收值代入蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出細(xì)胞蛋白含量;米諾環(huán)

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院博士學(xué)位論文圖3一5金黃色葡萄球菌濃度與0D值關(guān)系的曲線 1.80E+09160E+09 1.40E+091，20E+09 1.00E+09 8.OOE+086刀OE+08 4.00E+08IE+09X一IE+08 0.shlh 1.sh….2.5h2刀OE+08 0.00E+00.3h︵一已口媽日︶sn。﹄.n，JSO口。.~韶掃。呂�？趫D3一6金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線 1.00E+15鑒 1.o0E十14吸3一ooE+一3l，·。。E+，2巴 1.ooE+l-O呂一ooE+一。票 1.ooE+。9呂O口100E+08_____」Time(h)2.2.2金黃色葡萄球菌對(duì)成骨細(xì)胞的侵入能力分析金黃色葡萄球菌 ATCC25923對(duì)成骨細(xì)胞每孔的平均侵入菌落數(shù)15min為13士5;30min為435士31;45min為803士95;60min為1800士175。于15min時(shí)幾乎沒有細(xì)菌進(jìn)入成骨細(xì)胞，30min有細(xì)胞侵入并在1小時(shí)范圍內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)菌侵入成骨細(xì)胞的數(shù)量增多(因慶大霉素殺滅細(xì)胞外細(xì)菌后，最后一次洗液的菌落計(jì)數(shù)范圍為O一50CFU/孔，所以如果侵入細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)延50CFU/孔就認(rèn)為成骨細(xì)胞內(nèi)無(wú)金黃色葡萄球菌侵入)。金黃色葡萄球菌對(duì)成骨細(xì)胞的侵襲率=侵入細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)功口入細(xì)菌的總數(shù)。30min為0.0435%。

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院博士學(xué)位論文圖l一1成年SD大鼠單側(cè)下領(lǐng)骨圖1一2牙拔除后的成年SD大鼠單側(cè)下領(lǐng)骨圖大圖l一3從成年50大鼠下領(lǐng)骨上拔除的切牙和磨牙l一4酶消法培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞體積，呈三角形、長(zhǎng)梭形、鱗片狀(sd)‘200圖!一5骨組織法培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞體積列緊呈三角形、長(zhǎng)梭形，核圓，核仁明顯 (7d)X100圖1一6傳代成骨細(xì)胞(第一代)細(xì)胞排大，密呈編織骨樣(5d)“200
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2867729