絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平下降,易于引發(fā)骨質(zhì)疏松,對骨質(zhì)疏松與頜骨、牙槽骨關(guān)系的研究表明,骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后婦女下頜骨量與全身骨量有明顯的相關(guān)關(guān)系,絕經(jīng)后可出現(xiàn)不同程度的牙槽骨骨質(zhì)疏松癥狀[1-4]。雌激素替代療法(estrogen replacement treatment,ERT)可有效提高絕經(jīng)期婦女體內(nèi)雌激素的水平,是預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及骨折的有效方法[2],同時(shí),ERT也可減少牙周炎患者的牙齦出血和附著喪失,維持牙槽骨的骨量,提高牙齒的保留率[5,6]。牙周膜細(xì)胞是牙周膜內(nèi)的主要成分,對維持牙周膜的形態(tài)、功能有決定性的作用,并且在牙槽骨的改建中發(fā)揮重要作用。以往的研究顯示牙周膜細(xì)胞內(nèi)有雌激素受體的表達(dá),而且在外源性雌激素作用下,牙周膜細(xì)胞的成骨作用增強(qiáng)[7]。在牙周膜內(nèi)有數(shù)種細(xì)胞成分,除占主要地位的牙周膜成纖維細(xì)胞外,還有成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及未分化間充質(zhì)細(xì)胞--牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs),PDLSCs是牙周膜內(nèi)各主要功能細(xì)胞的來源[8],而PDLSCs與雌激素在牙周改建及再生過程中的關(guān)系尚無研究報(bào)道。由此,我們設(shè)想,牙周膜干細(xì)胞內(nèi)是否也有雌激素受體的表達(dá),如果有雌激素受體表達(dá),外源性雌激素對牙周膜干細(xì)胞成骨作用有何影響?通過本研究,我們將對這些問題進(jìn)行探討,以進(jìn)一步明確雌激素在牙周改建及再生中的作用機(jī)制,為牙周病及正畸臨床治療提供一定新的思路和理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容: (1)收集臨床拔除的正常人牙周健康、無齲的新鮮第三磨牙,刮取根中1/3牙周膜組織進(jìn)行牙周膜原代細(xì)胞培養(yǎng)。取第四代人牙周膜細(xì)胞,通過免疫磁珠技術(shù),以復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物STRO-1抗體的磁珠對人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行篩選、擴(kuò)增培養(yǎng),MTT法測定PDLSCs生長曲線并與牙周膜細(xì)胞進(jìn)行比較。 (2)取第三代PDLSCs進(jìn)行克隆形成率、細(xì)胞周期分析,對其生物學(xué)行為進(jìn)行研究;以流式細(xì)胞儀對PDLSCs及牙周膜細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面特異性抗原CD34、CD44、CD45、CD146表達(dá)測定;以免疫細(xì)胞化學(xué)方法對PDLSCs進(jìn)行干細(xì)胞表面特異性抗原STRO-1及間充質(zhì)細(xì)胞相對特異性抗原Vimentin表達(dá)測定;PDLSCs成脂及成骨多向誘導(dǎo)分化研究。通過上述實(shí)驗(yàn)對所分離的PDLSCs干細(xì)胞特征進(jìn)行鑒定。 (3)取第三代PDLSCs以免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行ERα及ERβ特異性抗體染色;以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測PDLSCs在雌激素作用前后ERα及ERβmRNA表達(dá)的變化并與牙周膜細(xì)胞作比較研究;以Western blot法分析PDLSCs在雌激素作用前后ERα及ERβ蛋白表達(dá)的變化并與牙周膜細(xì)胞作比較研究。 (4)取第三代PDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),加入不同濃度梯度(10-7、10-8、10-9M)的外源性雌激素(17β-雌二醇),MTT法測定成骨分化過程中的PDLSCs在雌激素作用下的細(xì)胞增殖變化情況。 (5)取第三代PDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),加入不同濃度梯度(10-7、10-8、10-9M)的外源性雌激素(17β-雌二醇),并以ER抑制劑ICI182780作對照,進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)變化及羥脯氨酸含量的檢測。 結(jié)果: (1)所篩選PDLSCs呈類梭形外觀,形態(tài)不規(guī)則,核為卵圓形、位于胞質(zhì)中央,似成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線示可見PDLSCs較牙周膜細(xì)胞生長慢,具有慢增殖周期的干細(xì)胞特點(diǎn)。 (2)PDLSCs生物學(xué)研究顯示其具備克隆形成能力及干細(xì)胞細(xì)胞周期特點(diǎn),流式分析顯示所分離PDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44及CD146,內(nèi)皮細(xì)胞及造血系細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34和CD45表達(dá)極低;干細(xì)胞表面特異性抗原STRO-1及間充質(zhì)細(xì)胞相對特異性抗原Vimentin染色均為陽性,此外,PDLSCs經(jīng)成脂及成骨誘導(dǎo)獲得了茜素紅染色陽性的類成骨細(xì)胞和油紅-O染色陽性的類脂肪細(xì)胞。 (3)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示ERα及ERβ在PDLSCs中均陽性表達(dá),定位于細(xì)胞核;RT-PCR及Western blot檢測示:在mRNA及蛋白水平,均可檢測到ERα及ERβ表達(dá),且ERα表達(dá)高于ERβ。此外,PDLSCs與同來源牙周膜細(xì)胞相比, ERα及ERβ的表達(dá)較高;而PDLSCs在雌激素作用后ERα及ERβ的表達(dá)較作用前均增加。 (4)在17-β雌二醇作用下,PDLSCs的增殖發(fā)生變化,與對照組相比,前3天雌激素干擾組細(xì)胞增殖受到抑制,此后雌激素干擾組細(xì)胞增殖高于對照組,在不同藥物濃度組間,1×10-7M組對細(xì)胞增殖影響最為明顯,其細(xì)胞增殖水平高于其余兩組。 (5)在17-β雌二醇作用下,PDLSCs堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)發(fā)生動態(tài)變化,自第三天開始,各組ALP表達(dá)均升高,而雌激素干擾組ALP表達(dá)量高于對照組,在不同藥物濃度組間1×10-7M組ALP表達(dá)增加高于其余兩組。 (6)在17-β雌二醇作用下,PDLSCsⅠ型膠原合成表達(dá)與對照組相比有增加趨勢,且與藥物濃度有劑量依賴關(guān)系,在不同藥物濃度組間1×10-7M組作用最為明顯。 結(jié)論: (1)用復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗體STRO-1的免疫磁珠可自牙周膜細(xì)胞中成功篩選PDLSCs,所篩選PDLSCs具有克隆形成、慢細(xì)胞周期、表達(dá)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物及多向分化能力等干細(xì)胞特點(diǎn)。 (2)PDLSCs中ERα及ERβ均有表達(dá),ERα表達(dá)高于ERβ,提示雌激素對PDLSCs的調(diào)控作用可能主要通過ERα途徑;在外源性雌激素作用下,成骨分化過程中ERα及ERβ表達(dá)均增加,提示PDLSCs可能是雌激素調(diào)控牙周改建的上游細(xì)胞,雌激素通過其受體對PDLSCs的成骨分化進(jìn)行調(diào)控。 (3)雌激素可促進(jìn)PDLSCs的增殖,并對PDLSCs成骨分化過程有促進(jìn)作用,該作用與ER及雌激素濃度密切相關(guān),提示雌激素可以通過PDLSCs促進(jìn)牙周改建及再生,對牙周損傷的恢復(fù)有積極的作用。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R78;R580
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文36圖1-1 篩選前牙周膜細(xì)胞 （×40） 圖1-2 篩選后的PDLSCs（×40）2.2 細(xì)胞生長曲線測定牙周膜細(xì)胞及牙周膜干細(xì)胞生長曲線均呈倒“S”形，在接種后1天兩者細(xì)胞量均減少，自第2天起，細(xì)胞生長均加速，第8天達(dá)到生長高峰，進(jìn)入“平臺期”，此后，細(xì)胞生長速度減慢。總體而言，干細(xì)胞生長速度明顯低于牙周膜細(xì)胞（圖1-3）。00.20.40.60.811 2 3

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文36圖1-1 篩選前牙周膜細(xì)胞 （×40） 圖1-2 篩選后的PDLSCs（×40）2.2 細(xì)胞生長曲線測定牙周膜細(xì)胞及牙周膜干細(xì)胞生長曲線均呈倒“S”形，在接種后1天兩者細(xì)胞量均減少，自第2天起，細(xì)胞生長均加速，第8天達(dá)到生長高峰，進(jìn)入“平臺期”，此后，細(xì)胞生長速度減慢�？傮w而言，干細(xì)胞生長速度明顯低于牙周膜細(xì)胞（圖1-3）。00.20.40.60.811 2 3 4 5 6 7 8 9 10培養(yǎng)時(shí)間（天）

胞量均減少，自第2天起，細(xì)胞生長均加速，第8天達(dá)到生長高峰，進(jìn)入“平臺期”，此后，細(xì)胞生長速度減慢�？傮w而言，干細(xì)胞生長速度明顯低于牙周膜細(xì)胞（圖1-3）。00.20.40.60.811 2 3 4 5 6 7 8 9 10培養(yǎng)時(shí)間（天）D值OPDLCPDLSC圖 1-3 牙周膜干細(xì)胞與牙周膜細(xì)胞生長曲線比較3 討論成體干細(xì)胞(adult stem cell)的研究是繼轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物、人類胚
【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2866072