目的 牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)是利用骨創(chuàng)傷后骨痂愈合機理產生新骨的一項內源性骨組織工程技術,已成為國內外口腔頜面外科研究的熱點之一,并且隨著近幾年來的大量基礎和臨床研究,展現(xiàn)了該技術在顱頜面整形、腫瘤術后重建、牙槽種植等方面廣闊的應用前景。盡管DO技術具有傳統(tǒng)手術難以比擬的優(yōu)勢,但過長的牽張和固定時間,以及由此而產生的諸多并發(fā)癥是限制其臨床應用的主要原因。如何提高DO過程中新骨形成的速度和質量,縮短DO治療時間,減少并發(fā)癥的發(fā)生是目前該領域的研究熱點。本研究的目的是擬通過RT-PCR技術從人骨肉瘤中提取并擴增hBMP-2基因片段,通過酶切技術將其插入pcDNA3.1構建成真核表達載體,利用基因轉染方法將其導入兔骨髓間充質干細胞(MSCs),并檢測其在MSCs中的表達情況。然后將BMP-2基因修飾的自體MSCs植入兔下頜牽張成骨區(qū),通過細胞可控地在需要的時段持續(xù)表達BMP-2,誘導MSCs自身或牽張成骨區(qū)的多潛能干細胞以及可能的成纖維細胞向成骨或成軟骨細胞分化,模擬胚胎骨形成或骨折愈合的自然發(fā)生過程,使成骨級聯(lián)再次啟動,重續(xù)定向成骨分化,最終達到促進牽張成骨新骨形成與改建,從而大大縮短牽張成骨治療周期,為進一步在臨床上廣泛使用牽張成骨技術治療各種骨創(chuàng)傷或骨缺損奠定基礎。 方法 1取2-3月齡健康新西蘭白兔,穿刺抽取雙側股骨大轉子部位骨髓約4-6 ml,采用貼壁分離法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞,通過細胞形態(tài)學觀察和細胞表面抗原檢測對細胞進行鑒定;并向成骨細胞分化誘導培養(yǎng),通過鈣鉆法檢測堿性磷酸酶表達,茜素紅染色觀察鈣結節(jié)形成能力。 2采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術,從人骨肉瘤中擴增出人骨形成蛋白-2基因片段,通過DNA重組技術將該基因片段重組于pcDNA 3.1真核表達載體上,構建成pcDNA3.1- hBMP-2重組質粒。通過用PCR擴增、酶切電泳分析及DNA測序的方法對重組DNA進行鑒定。 3采用比較成熟的脂質體介導的真核細胞轉染技術,將含人BMP-2編碼序列的真核表達質粒轉染兔BMSCs,通過逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫印跡法(westernblot)以及免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達。 4取健康新西蘭白兔36只隨機分為3組,每組12只。實驗組(注射BMP-2基因修飾的自體MSCs)、對照組(注射自體MSCs)、空白組(注射生理鹽水)。術前3-4周分別根據編號對實驗組及對照組動物自脛骨上端穿刺抽取骨髓,并做好對應編號進行傳代培養(yǎng),將兔自體MSCs培養(yǎng)傳代至第P3代細胞后用hBMP-2基因轉染修飾。建立牽張成骨動物模型,術后延遲期為5天,從術后第6天開始牽張,每天2次,每次0.5mm牽張,牽張長度7mm,隨后固定。在固定期第2天,實驗組于牽張間隙注射200μl的自體BMP-2基因修飾的自體MSCs液;對照組注射200μl的自體MSCs液;空白組注射200μl生理鹽水。分別于牽張結束固定2w、6w分別攝X線片觀察骨質愈合、改建情況;在固定術后2周、6周各實驗組分別處死動物6只,通過大體病理、HE染色組織切片及掃面電鏡觀察各實驗組新骨形成情況,并通過逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫組化等手段檢測BMP-2-mRNA及其蛋白的表達情況。 結果 1兔骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及向成骨細胞分化誘導: MSCs剛分離接種時,其內血細胞混雜,成分不易分辨。3天后首次換液,可見貼壁細胞呈三角形、成纖維形、多角形或短梭形外觀,培養(yǎng)10-20天后細胞長滿瓶底,可見成纖維樣細胞克隆樣增殖,成片生長。傳代后觀察:傳代后細胞增殖速度明顯加快,細胞排列整齊有序。使用條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)2周,細胞呈集落生長后開始形成鈣結節(jié),茜素紅染色陽性,證明MSC已被誘導成為成骨細胞。 2經PCR擴增、酶切電泳分析和DNA測序證實,本實驗成功構建的重組質粒目的基因片段為人BMP-2-cDNA。 3通過脂質體介導的真核轉染方法能成功將外源hBMP-2基因轉入兔骨髓間充質干細胞,并經RT-PCR、免疫組化和蛋白印跡法證實,轉染pcDNA3.1-hBMP-2后的兔骨髓間充質干細胞內有大量hBMP-2 mRNA的轉錄和蛋白的表達。 4動物實驗:于牽張結束固定2w、6w取標本,通過大體病理觀察,從新生骨表面看,從質量或者硬度上由高到低排列為:實驗組對照組=空白組;通過X線觀察并經過灰度值統(tǒng)計軟件分析,在固定期第2周及6周實驗組牽張區(qū)骨密度明顯高于對照組和空白組(p0.01),在各期對照組和空白組牽張區(qū)骨密度比較未見明顯差異(p0.05 );固定2w、6w通過RT-PCR檢測并通過電泳圖像灰度值分析,實驗組BMP-2mRNA相對光密度值顯著高于對照組和空白組(P0.01),而對照組和空白組BMP-2mRNA表達差別不大(P0.05);通過免疫組化顯示:實驗組固定2周、6周牽張間隙新生骨組織中均可見BMP-2強陽性表達,實驗組平均灰度值低于對照組和空白組(P0.01),而對照組和空白組間無差別(P0.05)。 結論 1全骨髓貼壁換液方法是一種簡單實用的分離培養(yǎng)方法,可獲得純度較高的兔骨髓間充質干細胞;原代和傳代保持了較高的增殖活力,經過誘導后可向成骨細胞分化,選取組織工程種子細胞以3代以前較為適宜。 2成功構建了人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因真核表達質粒pcDNA3.1-hBMP-2,為后續(xù)實驗奠定基礎。 3通過脂質體介導的真核轉染方法可以將外源hBMP-2基因轉入骨髓間充質干細胞,并使其獲得較為穩(wěn)定的表達。 4用BMP-2基因修飾的自體MSCs移植能有效促進兔下頜骨牽張成骨新骨形成,為臨床上縮短牽張成骨治療周期提供理論依據。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R782
【部分圖文】：

2.細胞培養(yǎng)圖 1-1 耳緣靜脈注射麻醉Fig 1-1 Anesthetization by the vein of ear rim圖 1-2 常規(guī)消毒雙側脛骨上端皮膚Fig 1-2 Sterilization of the skin of superiorextremity of bilateral tibias圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction

2.細胞培養(yǎng)圖 1-1 耳緣靜脈注射麻醉Fig 1-1 Anesthetization by the vein of ear rim圖 1-2 常規(guī)消毒雙側脛骨上端皮膚Fig 1-2 Sterilization of the skin of superiorextremity of bilateral tibias圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction

162.細胞培養(yǎng)將細胞接種于 5OmI 培養(yǎng)瓶，加入 DMEM 全培養(yǎng)液(以蓋過瓶底為度)，在 370C， 5%C02，濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.細胞純化接種后 60-80 分鐘，換液去除大部分懸浮細胞，加入全培養(yǎng)基 4-6ml，然后靜置原代培養(yǎng) 3 -4 天，半量換液，第 7 天全量換液，培養(yǎng)過程中倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，觀察到紡錘型成纖維樣細胞克隆形成后，說明MSCs 進入增殖期，這時每天換液，在原代培養(yǎng) 15 -20 天左右。觀察到成片的成纖維樣形態(tài)的細胞克隆，在瓶底用 Marker 筆標記，0.25%胰酶消化，圖 1-3 骨髓穿刺Fig 1-3 Bone marrow aspiration圖 1-4 抽取骨髓Fig 1-4 Bone marrow extraction
【參考文獻】

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本文編號：2861939