牙周炎等多種原因造成的牙周支持組織喪失是成人牙齒脫落的首要原因，牙周炎的治療和牙周缺損的修復(fù)是全世界關(guān)注的難題。雖然目前臨床常見牙周治療方法如潔治術(shù)、刮治術(shù)、翻瓣術(shù)等，能夠控制牙周炎癥的進展和阻止牙周支持組織的進一步喪失，卻不能使缺失的組織獲得良好的再生；引導(dǎo)組織再生術(shù)和植骨術(shù)的興起，給牙周炎的治療帶來新的希望，但適應(yīng)范圍狹窄、療效不穩(wěn)定且可預(yù)見性差。近年來，組織工程研究取得突飛猛進的發(fā)展，使利用組織工程的原理、技術(shù)和方法實現(xiàn)牙周組織再生成為可能。自2004年美國學(xué)者從人牙周膜組織中成功分離出牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）以來，利用干細胞移植（stem celltransplantation）技術(shù)修復(fù)牙周組織缺損成為牙周組織再生研究的主要策略。在大動物對照試驗研究中，利用骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）和PDLSCs修復(fù)牙周組織缺損都取得了很好的效果。2010年，世界上首篇將自體牙周膜來源的細胞用于牙周炎的臨床治療，文章發(fā)表在Oral Diseases上，將牙周細胞治療的研究和臨床應(yīng)用推進到一個從所未有的高度。 為了加快牙周細胞治療的臨床轉(zhuǎn)化，選擇適用范圍廣、操作簡便、安全有效、經(jīng)濟實惠的細胞輸送（cell delivery）方法成為我們必需解決的關(guān)鍵問題。研究表明，利用細胞膜片（cell sheet）技術(shù)可以保留細胞體外培養(yǎng)時形成的細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）和細胞與細胞之間的連接，從而避免外源性生物材料的應(yīng)用，提高細胞移植的植活率。同時良好的生物相容性、可操作性、可量化控制、調(diào)節(jié)膜片的大小和厚度，使得細胞膜片技術(shù)成為細胞移植（cell transplantation）首選方法之一。1993年，日本學(xué)者Okano等建立了溫度敏感性培養(yǎng)皿制備細胞膜片的方法，隨后國內(nèi)外學(xué)者就如何簡便獲得高效的細胞膜片方面進行了大膽的嘗試。本實驗室2010年報道了通過維生素C誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得細胞膜片的方法，使細胞膜片的制備變得更加簡單。進一步深入探索安全有效且簡便易行的膜片改良技術(shù)可以加速細胞治療牙周病的臨床轉(zhuǎn)化進程。證據(jù)表明，中草藥中具有多種生物活性分子，這些活性成分有望成為生長因子的替代品，用于細胞生物學(xué)性能的體內(nèi)外調(diào)節(jié)研究中。天然化合物蛇床子素（Osthole）是從蛇床、歐前胡等傳統(tǒng)中草藥中提取的香豆素類化合物，價格便宜、制備簡單；體內(nèi)外試驗中發(fā)現(xiàn)其具有促進細胞的增殖和骨向分化能力，可以有效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。因此，在細胞膜片制備過程中，加入蛇床子素有望會促進細胞膜片的形成，提高膜片的成骨效能。本課題旨在探索Osthole對PDLSCs和頜骨來源的BMMSCs（Jaw BMMSCs, JBMMSCs）兩種細胞的膜片形成及其增殖與骨向分化能力的影響，為中藥小分子化合物用于細胞膜片技術(shù)的改良和加速牙周細胞治療的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。 目的： 通過體外Osthole對人PDLSCs和JBMMSCs的生物學(xué)性能的影響，篩選合適的給藥濃度；探索篩選濃度下，Osthole對兩種細胞膜片形成及其成骨效能的影響，為中藥小分子化合物用于細胞膜片技術(shù)的改良和加速牙周細胞治療的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。 方法： 1. PDLSCs和JBMMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用改良組織塊法、差異貼壁法分別培養(yǎng)原代牙周膜細胞和頜骨骨髓基質(zhì)細胞；通過有限稀釋法分離、純化PDLSCs和JBMMSCs。流式細胞術(shù)檢測相關(guān)干細胞表面標(biāo)記物；噻唑藍(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)比色法、成纖維細胞集落形成單位（Colony formingunit-firbroblast, CFU-F）檢測細胞自我更新能力；成骨、成脂誘導(dǎo)檢測細胞的多向分化功能。 2. Osthole最佳細胞作用濃度的篩選：設(shè)立Osthole不同濃度組（0Mol/L，10-4Mol/L，10-5Mol/L，10-6Mol/L和10-7Mol/L），通過MTT法檢測細胞增殖、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色和ALP定量試劑盒檢測細胞的ALP活性的方法，結(jié)合兩種細胞的作用數(shù)據(jù)，確定Osthole最佳細胞作用的濃度。 3. Osthole對兩種細胞膜片形成和成骨性能的影響：按照篩選的Osthole濃度，進一步探索干預(yù)時間對兩種細胞膜片形成和性能的影響。兩種細胞均設(shè)：無Osthole干預(yù)組（Control組）、Osthole早期干預(yù)（前3天）組（Osthole1組）、Osthole全程干預(yù)組（Osthole2組）、Osthole后期干預(yù)（后3天）組（Osthole3組），細胞培養(yǎng)10天后獲取細胞膜片，通過蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin, HE）染色、掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）、蛋白免疫印跡法（Weston-Blot）、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測細胞膜片形成能力；同時，設(shè)置平行對照組，對細胞膜片進行成骨誘導(dǎo)，通過ALP染色、茜素紅染色、RT-PCR檢測其成骨能力，總結(jié)最佳的干預(yù)方法。 4.體內(nèi)異位移植，檢測兩種細胞膜片成骨能力：根據(jù)上述實驗結(jié)果，獲取最佳Osthole干預(yù)方法下制備的細胞膜片，對兩種細胞膜片的體內(nèi)異位成骨能力進行評價，無Osthole干預(yù)獲得的細胞膜片作為對照。細胞膜片復(fù)合羥基磷灰石-磷酸三鈣（Hydroxyapatite-tricalcium phosphate, HA-TCP）植入裸鼠皮下，四周后取材，HE染色觀察成骨效果。 5.統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）形式表示，多個樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)p值取雙側(cè)0.05. 結(jié)果： 1.所有標(biāo)本均成功獲得PDLSCs和JBMMSCs，顯微鏡下觀察細胞均呈梭形，具有自我增殖能力和細胞克隆能力（PDLSCs16%±0.8%；JBMMSCs8.75%±0.6%），流式細胞檢測顯示STRO-1、CD105、CD29、CD90、CD146等間充質(zhì)來源干細胞標(biāo)記表達陽性，CD31、CD45造血干細胞標(biāo)記表達陰性。成骨染色可見到鈣化結(jié)節(jié)沉積，成脂染色可見脂滴的形成。 2.經(jīng)不同濃度Osthole干預(yù)培養(yǎng)后，MTT檢測結(jié)果顯示：濃度為10-5Mol/L的Osthole具有最顯著的促進兩種細胞增殖的效果（P0.05）； ALP染色和ALP定量分析結(jié)果也顯示10-5Mol/L為促進細胞骨向分化的最佳給藥濃度。 3. Osthole在不同時間點加入細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)10天后HE染色顯示：不同干預(yù)方法獲得的PDLSC膜片，細胞層數(shù)多為1-2層，而JBMMSC膜片中，細胞層數(shù)多為2-3層；Weston-Blot和RT-PCR檢測結(jié)果顯示：在PDLSCs各組膜片中，F(xiàn)ibronectin蛋白合成和基因表達與對照組（無Osthole干預(yù)組）相比，明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。JBMMSCs形成的膜片中，Osthol1組（早期干預(yù)）與其它組相比，I型膠原（Collagen-I,Col-1）、β1整合素（Integrin-β1）、纖連蛋白（Fibronectin）的蛋白分泌及相關(guān)基因表達水平明顯增高（P0.05）。 4. Osthole干預(yù)誘導(dǎo)形成的細胞膜片經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對于JBMMSCs而言，Osthole1中的成骨相關(guān)基因[ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX-2)、骨鈣素（osteocalcin,OCN）]表達明顯提高（P0.05）；而其余兩組與對照組相比無明顯差異（P0.05）；而對于PDLSCs而言，Osthole2組（全程干預(yù)）中細胞的骨向分化趨勢更為明顯（P0.05）。 5.體內(nèi)移植4周后，PDLSCs/osthole組、JBMMSCs組、JBMMSCs/osthole組形成的細胞膜片在HA-TCP表面及材料間隙之間均形成了大量的類骨質(zhì)樣新生骨，新生骨表面可見成骨樣細胞及骨陷窩。而PDLSCs組雖然有新生骨的形成，但在材料表面主要以纖維包裹為主。定量分析顯示Osthole干預(yù)組與未干預(yù)組相比，新骨形成量具有非常明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P0.001）。兩種細胞間比較，無Osthole干預(yù)下，JBMMSCs具有更強的成骨能力（P0.05），而經(jīng)過蛇床子素干預(yù)培養(yǎng)后，兩種細胞膜片新骨形成無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論 1. Osthole給藥濃度對人PDLSCs和JBMMSCs的生物學(xué)性能產(chǎn)生不同程度的影響，10-5Mol/L濃度更有利于兩種細胞的增殖和成骨分化。 2. Osthole干預(yù)時間對兩種細胞影響不同：在JBMMSC膜片形成早期、PDLSCs膜片形成全過程中使用濃度為10-5Mol/L的Osthole進行干預(yù)，可以獲得具有良好成骨分化能力的細胞膜片。 3.無論是PDLSCs，還是JBMMSCs，Osthole干預(yù)誘導(dǎo)形成的細胞膜片與未干預(yù)的細胞膜片相比，在體內(nèi)均具有更強的異位成骨能力。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文D90(99.4%)；陰性表達造血干細胞標(biāo)記 CD31(3.2%)和 CD45(2.9%);以上結(jié)果符合質(zhì)來源的干細胞特征（圖 2）。

PDLSCs和JBMMSCs表面CD分子表型檢測

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 細胞自我更新能力鑒定低密度接種 PDLSCs 與 JBMMSCs,常規(guī)培養(yǎng) 14d 后，兩種細胞均可呈集落樣生長，具有單克隆形成能力(CFU-F）（圖 3A&B）。其中 PDLSCs 克隆形成率為 16%0.8%，JBMMSCs 克隆形成率為 8.75% ± 0.6%（圖 3C）。MTT 生長曲線顯示，分離培養(yǎng)的 PDLSCs 和 JBMMSCs 細胞均在培養(yǎng) 4d 后進入生長對數(shù)期，7d 后仍呈快速增長趨勢；PDLSCs 自第 4d 起增殖活性明顯高于 JBMMSCs（p<0.05）（圖 3D）。
【參考文獻】

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1 張巧艷;鄭漢臣;秦路平;;蛇床子素在植物界的分布及藥理活性[J];國外醫(yī)藥(植物藥分冊);2002年01期

2 張春梅;馮霞;鐘藝;;蛇床子的藥理研究進展[J];實用藥物與臨床;2006年01期

3 郭延偉;李松;房殿吉;;BMSCs/PRF復(fù)合載蛇床子素支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實驗研究[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2012年11期

4 王艷;潘永梅;;蛇床子素對新生大鼠顱骨成骨細胞中OPG、RANKL mRNA表達的影響[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年03期

5 王建華,宋冬梅,劉楠,李恩;蛇床子素對大鼠成骨細胞增殖分化的影響[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2004年01期

6 劉思景;郭偉韜;王輝;;骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化信號通路的研究進展[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2009年14期

7 李靈芝;倪寧;張永亮;龔海英;崔穎;;蛇床子素對成骨樣細胞UMR106增殖和分化的影響[J];中國臨床康復(fù);2006年09期

8 胡煒;俞興;徐林;;骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化成骨方法及相關(guān)研究進展[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年01期

9 明磊國;葛寶豐;陳克明;馬慧萍;翟遠坤;;蛇床子素對體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞增殖與成骨性分化的影響[J];中國藥理學(xué)通報;2010年08期

10 明磊國;王鳴剛;陳克明;周建;韓桂秋;朱瑞清;;蛇床子素對體外培養(yǎng)破骨細胞骨吸收及細胞凋亡的影響[J];藥學(xué)學(xué)報;2012年02期

本文編號：2856769