目的:牙周病是一種慢性破壞性疾病,可造成牙周支持組織的破壞和附著喪失,最終導(dǎo)致牙齒喪失。牙周病治療的最終目的是獲得牙周支持組織的再生,即牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)的再生。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,應(yīng)用組織工程支架材料修復(fù)牙周組織的缺損,成為目前研究牙周病治療的熱點。玉米醇溶蛋白是從玉米中萃取而成,具有良好的成膜性、黏接性和防水、防濕性能,并且還具有耐酸、耐油等特性。根據(jù)玉米醇溶蛋白的特性,其被廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥方面,而將其作為支架材料應(yīng)用于牙周組織工程的研究卻很少。本研究將中藥雙黃補作為一種生長因子與玉米醇溶蛋白支架結(jié)合,探討雙黃補對牙周膜細(xì)胞在玉米醇溶蛋白支架材料上黏附、生長及增殖的影響,研究雙黃補-玉米醇溶蛋白作為一種復(fù)合材料應(yīng)用于牙周組織工程的可行性。 方法: 1牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng) 選擇健康青少年因正畸拔除的健康前磨牙,無菌條件下用PBS或DMEM沖洗3次,刮取根中1/3牙周膜組織,采用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞。 2免疫組化ABC法進行來源鑒定 取生長良好的第2代細(xì)胞進行爬片培養(yǎng)72h,PBS清洗3次,4%的多聚甲醛室溫固定20分鐘;PBS清洗3次,0.1%Triton X 100孵育10min;3%的過氧化氫室溫阻斷20min;PBS清洗3次,加入稀釋度為1:80的鼠抗人波形絲蛋白(Vimentin)和1:120的兔抗人角蛋白(Cytokeratin,CK)一抗室溫1h;PBS清洗3次,加入二抗室溫孵育20min;PBS清洗3次,加入DAB顯色劑,蘇木素復(fù)染;同時用PBS代替一抗作陰性對照,顯微鏡下觀察照相。 3雙黃補煎液的制備 將黃連、黃芩、骨碎補按一定比例混合,煎前用過濾水或蒸餾水浸泡30分鐘,分別加8倍體積及6倍體積水煎2次,第1次2h,第2次1.5h,水提醇沉法制備成1 g/mL生藥的雙黃補煎液,加1%活性炭脫色3次,調(diào)pH至7.0～7.1, 4℃保存?zhèn)溆谩?4玉米醇溶蛋白支架材料的制備與預(yù)處理 按一定比例稱取氯化鈉,將其加入玉米醇溶蛋白酒精溶液中,邊加熱邊攪拌至均勻分散,采用溶劑澆鑄/粒子瀝濾法制備玉米醇溶蛋白支架。玉米醇溶蛋白支架紫外線消毒2h后備用。 5 MTT法檢測牙周膜細(xì)胞的增殖活性 將玉米醇溶蛋白支架按1 cm~2/mL的比例置含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中,37℃浸提72 h,收集浸提液并配制50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL質(zhì)量濃度的雙黃補培養(yǎng)液,備用。取第5代培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~4 /ml接種于96孔板,每孔100μl,37℃5% CO2培養(yǎng)24h,棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。隨機分為玉米醇溶蛋白支架浸提液配制的不同濃度雙黃補組(雙黃補-Zein支架浸提液組)、玉米醇溶蛋白支架浸提液組及細(xì)胞對照組,MTT法檢測牙周膜細(xì)胞的增殖活性。 6倒置相差顯微鏡及掃描電鏡觀察 將預(yù)先處理好的玉米醇溶蛋白支架放于24孔板中,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液37℃浸泡24h。取第5代培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×10~5 /ml接種于24孔板中支架上,每孔200μl,隨后加入800μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,37℃5%CO2培養(yǎng)24h。棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,隨機分為實驗組和對照組,三周后倒置相差顯微鏡及掃描電鏡進行觀察。 7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,進行單因素方差分析, P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1細(xì)胞培養(yǎng)及來源鑒定 牙周膜細(xì)胞于培養(yǎng)的第5～7天從組織塊游出,呈放射狀排列生長,細(xì)胞為梭形或星形,胞體豐滿,胞漿均勻,核圓形或卵圓形。來源鑒定結(jié)果顯示,波形絲蛋白陽性,胞漿棕黃色著色,細(xì)胞角蛋白陰性,證實其為中胚層來源的成纖維細(xì)胞,可用于實驗。 2雙黃補對牙周膜細(xì)胞在玉米醇溶蛋白支架材料上增殖活性的影響MTT結(jié)果顯示,與細(xì)胞對照組及玉米醇溶蛋白支架浸提液組相比,玉米醇溶蛋白支架浸提液配制的不同濃度雙黃補均能促進牙周膜細(xì)胞的增殖,具有劑量依賴性,且以100μg/mL質(zhì)量濃度的雙黃補促增殖作用最明顯(P 0.01),統(tǒng)計學(xué)意義顯著。玉米醇溶蛋白支架浸提液組與細(xì)胞對照組相比,兩者之間無明顯差異(P 0.05),說明玉米醇溶蛋白支架浸提液不影響牙周膜細(xì)胞的生長。 3雙黃補對牙周膜細(xì)胞在玉米醇溶蛋白支架材料上黏附生長影響的形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡觀察,在雙黃補作用下玉米醇溶蛋白支架上黏附生長的牙周膜細(xì)胞數(shù)目較多,細(xì)胞呈長梭形,橫跨支架孔隙交織成網(wǎng)狀,而無雙黃補作用的玉米醇溶蛋白支架上黏附生長的細(xì)胞數(shù)目較少。掃描電鏡觀察,在雙黃補作用下玉米醇溶蛋白支架上生長的牙周膜細(xì)胞數(shù)目較多,主要黏附生長在支架孔隙的周邊,呈長梭形或星形,伸出偽足并橫跨孔隙交織成網(wǎng)狀,在支架表面及孔隙陷窩內(nèi)也有生長。而無雙黃補作用的玉米醇溶蛋白支架上生長的細(xì)胞數(shù)目較少,多呈星形,主要黏附生長在孔隙陷窩內(nèi)。在細(xì)胞形態(tài)上,雙黃補作用下在玉米醇溶蛋白支架上黏附生長的牙周膜細(xì)胞多為梭形,胞體豐滿,胞漿均勻,立體感強。 結(jié)論:雙黃補能促進牙周膜細(xì)胞在玉米醇溶蛋白支架上的黏附、生長與增殖。雙黃補作為一種生長因子與玉米醇溶蛋白支架結(jié)合,作為一種復(fù)合支架材料應(yīng)用于牙周組織工程具有可行性。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R781.4
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
附表
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述 牙周病治療及牙周組織工程研究進展
    參考文獻
致謝
個人簡歷

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張曉靜;雙黃補在牙周組織工程中對牙周組織再生修復(fù)的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2849293