目的:牙根吸收是正畸矯正過程中最常見的并發(fā)癥之一,吸收嚴重者會發(fā)生牙齒的松動甚至脫落,牙根的吸收和修復主要由成牙骨質細胞調節(jié),本實驗將探討人尿源性干細胞(hUSCs)對成牙骨質細胞增殖和成骨的影響,從而為臨床應用hUSCs促進移動性牙根吸收修復提供一定的理論基礎。實驗分為兩個部分。實驗一:hUSCs對成牙骨質細胞(OCCM-30)生長及增殖的影響方法:1、應用高速離心法從人新鮮尿液中提取hUSCs,鏡下觀察其形態(tài);2、流式細胞術檢測其表面標志物,鑒定hUSCs;將hUSCs與OCCM-30按不同比例分為4組(G1:1:1,G2:2:1,G3:3:1及OCCM-30對照組),間接共培養(yǎng)兩種細胞,共培養(yǎng)12h和24h后,鏡下觀察成牙骨質細胞的生長情況;3、共培養(yǎng)1d、3d和7d后,通過CCK8技術檢測成牙骨質細胞的增殖情況。結果:1、hUSCs形態(tài)觀察:從人新鮮尿液中成功提取h USCs,鏡下觀察發(fā)現,接種3-7d開始貼壁,7-10d開始集落狀生長,10~14 d細胞數達50%~60%可傳代,形態(tài)多呈米粒狀,少數呈卵圓形或短梭形,經過傳代至P3左右時細胞形態(tài)基本保持米粒狀,培養(yǎng)至P8細胞開始凋亡;2、hUSCs的鑒定:流式細胞術檢測hUSCs表面標志物,結果顯示:CD29、CD73、CD90、CD146為陽性,CD34、CD133表達為陰性,具有間充質干細胞(MSCs)特性;3、鏡下觀察共培養(yǎng)后成牙骨質細胞生長情況:各組成牙骨質細胞均出現貼壁生長和增殖,其中G3組中成牙骨質細胞增殖速度最快為70%,覆蓋率最高為100%。4、CCK8檢測共培養(yǎng)后成牙骨質細胞增殖:OD值隨著培養(yǎng)時間的增加而增加,各實驗組的OD值均顯著大于對照組(P0.05),G3組的OD值顯著大于其他實驗組(P0.05),將hUSCs和OCCM-30以3:1間接共培養(yǎng)后能顯著促進成牙骨質細胞的增殖。實驗二:hUSCs對成牙骨質細胞(OCCM-30)成骨的影響方法:實驗分組和共培養(yǎng)方式同實驗一,采用成骨誘導培養(yǎng)基對hUSCs和成牙骨質細胞進行定向成骨誘導;共培養(yǎng)7d后,進行堿性磷酸酶(ALP)染色;于3d、5d和7d后,進行ALP活性測定;共培養(yǎng)12d后,進行茜素紅染色;共培養(yǎng)7d和12d后,實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測OPN、OCN的表達;結果:1、ALP染色:細胞質內呈現藍色顆粒表示陽性,所有實驗組細胞質內藍色顆粒均顯著多于對照組,各實驗組間無差異。2、ALP活性檢測:各組中ALP活性隨著誘導時間的增加而增加,7天時活性最強,各實驗組顯著大于對照組(P0.05),G3組顯著高于其他實驗組(P0.05)。3、茜素紅染色:實驗組紅染成骨鈣化結晶分布多于對照組,G3組成骨鈣化結晶分布最多。3、q-PCR結果顯示:G3組中OPN、OCN的表達隨著成骨誘導時間的增加而增加,其余組無明顯變化;G3組中OPN、OCN的表達顯著高于G1組、G2組和對照組(P0.05),G1組、G2組與對照組無顯著差異(P0.05)。結論:hUSCs能顯著促進成牙骨質細胞的增殖和成骨,為臨床應用h USCs促進牙根吸收的修復提供了一定的理論基礎。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R783.5
【部分圖文】：

2）hUSCs 的準備：將生長密度約為 80%-90%P3 代 hUSCs 棄去原培養(yǎng)基，PBS沖洗 3 次，加入 0.25%胰酶 200μl 消化 2min，加入 hUSC 培養(yǎng)基終止消化后將細胞轉移至 15ml 離心管內，離心（1000rpm／5min)后加入新鮮 hUSCs 培養(yǎng)基得細胞懸液。使用細胞計數板將濃度調整為 1×105/ml。3）hUSCs 與 OCCM-30 間接共培養(yǎng)：將 OCCM-30 以濃度為 1×105/ml 鋪于懸掛式 24 孔板中，每孔 500μl，共同培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為 hUSCs 培養(yǎng)基。將 P3 代hUSCs 以不同比例轉移至孔板內懸掛小室中（圖 1）。hUSCs：OCCM-30 個數比為1:1 組為 G1，hUSCs：OCCM-30 個數比為 2:1 組為 G2，hUSCs：OCCM-30 個數比為 3:1 組為 G3。OCCM-30 單獨成骨誘導為陰性對照組。于細胞培養(yǎng)箱內共同培養(yǎng) 12h、24h 后，移去孔板內所有 hUSCs 小室，鏡下觀察 OCCM-30 生長形態(tài)以及增殖情況，每組重復 3 次。

經 3-5d 后傳代為 P3 開始密集生長（圖 2C），7d 后傳代為 P5，可見細胞多呈米粒樣形態(tài)（圖2D）。圖 2:hUSCs 細胞形態(tài)（A.原代細胞；B.P1 代細胞；C.P3 代細胞；D.P5 代細胞）（×40）Fig.2：Morphology of hUSC（sA. Primary cell;B. The first passage;C. The third passage;D. Thefifth passage）（×40）

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文2.2 hUSCs 表面標志物的鑒定hUSCs 表面標志物的鑒定結果見圖 3 和表 1。流式細胞術檢測細胞表面標志物顯示：CD29、CD73、CD90、CD146 為陽性, CD34、CD133 表達為陰性。CD29、CD73、CD90、CD146 為 MSCs 表面特異性標志物，而 CD34 是造血干細胞的表面特異性標志物，CD133 是造血干細胞和上皮細胞共同的特異性標志物，此結果說明 hUSCs 具有 MSCs 的類似表面標志物，屬于 MSCs 的一類。
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本文編號：2848374