目的:牙根吸收是正畸矯正過(guò)程中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,吸收嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生牙齒的松動(dòng)甚至脫落,牙根的吸收和修復(fù)主要由成牙骨質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié),本實(shí)驗(yàn)將探討人尿源性干細(xì)胞(hUSCs)對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖和成骨的影響,從而為臨床應(yīng)用hUSCs促進(jìn)移動(dòng)性牙根吸收修復(fù)提供一定的理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。實(shí)驗(yàn)一:hUSCs對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞(OCCM-30)生長(zhǎng)及增殖的影響方法:1、應(yīng)用高速離心法從人新鮮尿液中提取hUSCs,鏡下觀察其形態(tài);2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志物,鑒定hUSCs;將hUSCs與OCCM-30按不同比例分為4組(G1:1:1,G2:2:1,G3:3:1及OCCM-30對(duì)照組),間接共培養(yǎng)兩種細(xì)胞,共培養(yǎng)12h和24h后,鏡下觀察成牙骨質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;3、共培養(yǎng)1d、3d和7d后,通過(guò)CCK8技術(shù)檢測(cè)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:1、hUSCs形態(tài)觀察:從人新鮮尿液中成功提取h USCs,鏡下觀察發(fā)現(xiàn),接種3-7d開(kāi)始貼壁,7-10d開(kāi)始集落狀生長(zhǎng),10~14 d細(xì)胞數(shù)達(dá)50%~60%可傳代,形態(tài)多呈米粒狀,少數(shù)呈卵圓形或短梭形,經(jīng)過(guò)傳代至P3左右時(shí)細(xì)胞形態(tài)基本保持米粒狀,培養(yǎng)至P8細(xì)胞開(kāi)始凋亡;2、hUSCs的鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUSCs表面標(biāo)志物,結(jié)果顯示:CD29、CD73、CD90、CD146為陽(yáng)性,CD34、CD133表達(dá)為陰性,具有間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)特性;3、鏡下觀察共培養(yǎng)后成牙骨質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況:各組成牙骨質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)和增殖,其中G3組中成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖速度最快為70%,覆蓋率最高為100%。4、CCK8檢測(cè)共培養(yǎng)后成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖:OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加,各實(shí)驗(yàn)組的OD值均顯著大于對(duì)照組(P0.05),G3組的OD值顯著大于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05),將hUSCs和OCCM-30以3:1間接共培養(yǎng)后能顯著促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)二:hUSCs對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞(OCCM-30)成骨的影響方法:實(shí)驗(yàn)分組和共培養(yǎng)方式同實(shí)驗(yàn)一,采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)hUSCs和成牙骨質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行定向成骨誘導(dǎo);共培養(yǎng)7d后,進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色;于3d、5d和7d后,進(jìn)行ALP活性測(cè)定;共培養(yǎng)12d后,進(jìn)行茜素紅染色;共培養(yǎng)7d和12d后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)OPN、OCN的表達(dá);結(jié)果:1、ALP染色:細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色顆粒表示陽(yáng)性,所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)色顆粒均顯著多于對(duì)照組,各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)差異。2、ALP活性檢測(cè):各組中ALP活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加,7天時(shí)活性最強(qiáng),各實(shí)驗(yàn)組顯著大于對(duì)照組(P0.05),G3組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05)。3、茜素紅染色:實(shí)驗(yàn)組紅染成骨鈣化結(jié)晶分布多于對(duì)照組,G3組成骨鈣化結(jié)晶分布最多。3、q-PCR結(jié)果顯示:G3組中OPN、OCN的表達(dá)隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加,其余組無(wú)明顯變化;G3組中OPN、OCN的表達(dá)顯著高于G1組、G2組和對(duì)照組(P0.05),G1組、G2組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論:hUSCs能顯著促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨,為臨床應(yīng)用h USCs促進(jìn)牙根吸收的修復(fù)提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R783.5
【部分圖文】：

2）hUSCs 的準(zhǔn)備：將生長(zhǎng)密度約為 80%-90%P3 代 hUSCs 棄去原培養(yǎng)基，PBS沖洗 3 次，加入 0.25%胰酶 200μl 消化 2min，加入 hUSC 培養(yǎng)基終止消化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管內(nèi)，離心（1000rpm／5min)后加入新鮮 hUSCs 培養(yǎng)基得細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)整為 1×105/ml。3）hUSCs 與 OCCM-30 間接共培養(yǎng)：將 OCCM-30 以濃度為 1×105/ml 鋪于懸掛式 24 孔板中，每孔 500μl，共同培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為 hUSCs 培養(yǎng)基。將 P3 代hUSCs 以不同比例轉(zhuǎn)移至孔板內(nèi)懸掛小室中（圖 1）。hUSCs：OCCM-30 個(gè)數(shù)比為1:1 組為 G1，hUSCs：OCCM-30 個(gè)數(shù)比為 2:1 組為 G2，hUSCs：OCCM-30 個(gè)數(shù)比為 3:1 組為 G3。OCCM-30 單獨(dú)成骨誘導(dǎo)為陰性對(duì)照組。于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng) 12h、24h 后，移去孔板內(nèi)所有 hUSCs 小室，鏡下觀察 OCCM-30 生長(zhǎng)形態(tài)以及增殖情況，每組重復(fù) 3 次。

經(jīng) 3-5d 后傳代為 P3 開(kāi)始密集生長(zhǎng)（圖 2C），7d 后傳代為 P5，可見(jiàn)細(xì)胞多呈米粒樣形態(tài)（圖2D）。圖 2:hUSCs 細(xì)胞形態(tài)（A.原代細(xì)胞；B.P1 代細(xì)胞；C.P3 代細(xì)胞；D.P5 代細(xì)胞）（×40）Fig.2：Morphology of hUSC（sA. Primary cell;B. The first passage;C. The third passage;D. Thefifth passage）（×40）

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.2 hUSCs 表面標(biāo)志物的鑒定hUSCs 表面標(biāo)志物的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖 3 和表 1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物顯示：CD29、CD73、CD90、CD146 為陽(yáng)性, CD34、CD133 表達(dá)為陰性。CD29、CD73、CD90、CD146 為 MSCs 表面特異性標(biāo)志物，而 CD34 是造血干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志物，CD133 是造血干細(xì)胞和上皮細(xì)胞共同的特異性標(biāo)志物，此結(jié)果說(shuō)明 hUSCs 具有 MSCs 的類(lèi)似表面標(biāo)志物，屬于 MSCs 的一類(lèi)。
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本文編號(hào)：2848374