背景:牙周膜是連接著牙槽骨和牙骨質(zhì)的特殊致密結(jié)締組織。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)通常指牙周膜中以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞群,具有多向分化和自我更新的能力,在牙周組織再生治療和正畸治療中都發(fā)揮著重要作用。初級纖毛是廣泛存在于多種細(xì)胞表面的保守細(xì)胞器,缺失會導(dǎo)致一系列“纖毛病”。初級纖毛的形成和維持需要纖毛運輸?shù)鞍?Intraflagella Transport,IFT)不斷的貨物運輸。IFT88為FT-B復(fù)合體的核心組分,破壞此蛋白會導(dǎo)致初級纖毛形成缺陷。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),初級纖毛在感知機械應(yīng)力,調(diào)節(jié)骨平衡方面發(fā)揮著重要作用。目的:第一部分:構(gòu)建IFT88基因沉默模型抑制hPDLCs初級纖毛的形成。探討抑制hPDLCs中初級纖毛形成后對其增殖和成骨分化能力的影響。第二部分:利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探討初級纖毛在hPDLCs感知靜壓力過程中發(fā)生變化的相關(guān)纖毛基因和調(diào)控機制。方法:第一部分:組織塊法原代培養(yǎng)和鑒定hPDLCs,取第4-7代細(xì)胞進行實驗。構(gòu)建shIFT88慢病毒載體,對hPDLCs進行慢病毒感染,得到IFT88基因沉默表達的hPDLCs細(xì)胞株(shIFT88組),同時感染無意序列作為對照(NC組)。western blot和定量PCR檢測IFT88沉默效率,免疫熒光檢測初級纖毛的形成率。平板克隆實驗和MTT實驗檢測細(xì)胞增殖,定量PCR檢測NC組和shIFT88組成骨相關(guān)因子COLIA1、ALP、Runx2、BMP2表達量變化。第二部分:模擬正畸壓應(yīng)力構(gòu)建體外靜壓力模型。取第4-7代NC組和shIFT88組細(xì)胞接種于6孔板,NC組和shIFT88組分別設(shè)置不加靜壓力的對照組和施加2g/cm2靜壓力4h的實驗組。收樣提取RNA,檢測RNA質(zhì)量合格后送樣進行建庫,測序,篩選出差異基因(differentially expression genes,DEGs)并進行分析。結(jié)果:1.免疫熒光顯示:人牙周膜細(xì)胞表面存在初級纖毛,纖毛率為60.27±1.83%。2.成功構(gòu)建hPDLCs中IFT88基因沉默模型。沉默IFT88基因表達后,hPDLCs初級纖毛率明顯降低(P0.01)。3.hPDLCs中初級纖毛形成抑制后細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P0.01),成骨相關(guān)因子 COL1A1、ALP、Runx2、BMP2 表達量明顯下調(diào)(P0.01)。4.測序結(jié)果分析得出,與不加靜壓力的對照組細(xì)胞相比,施加靜壓力4h后,NC組有840個差異表達基因,shIFT88組有498個差異表達基因。5.將差異表達基因與纖毛金標(biāo)準(zhǔn)庫進行比對,NC組發(fā)現(xiàn)8個上調(diào)纖毛基因和2個下調(diào)纖毛基因,shIFT88組未發(fā)現(xiàn)相關(guān)纖毛基因。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)TGF-beta signaling pathway 和 osteoclast differentiation 在 NC 組發(fā)生富集,而在shIFT88組未發(fā)生富集。選取部分差異表達基因進行熒光定量PCR驗證,變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果一致。結(jié)論:人牙周膜細(xì)胞存在初級纖毛,IFT88基因沉默能有效抑制初級纖毛的形成。初級纖毛形成抑制后hPDLCs增殖能力減弱,成骨相關(guān)因子的基礎(chǔ)表達量明顯下調(diào),說明初級纖毛有可能參與調(diào)控hPDLCs的增殖和成骨向分化。hPDLCs感知靜壓力過程中NC組多個纖毛基因發(fā)生變化,TGF-beta signaling pathway和osteoclast differentiation均被激活,抑制初級纖毛形成后這些纖毛基因和通路的變化均未被檢測到。初級纖毛可能通過這些纖毛基因調(diào)控TGF-beta信號通路和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化進而參與hPDLCs感知靜壓力調(diào)節(jié)骨平衡的生理過程。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781
【部分圖文】：

穩(wěn)態(tài)的研宄進展做以下綜述。??１．纖毛的基本結(jié)構(gòu)和功能??１．１纖毛的基本結(jié)構(gòu)（圖１）??纖毛的結(jié)構(gòu)在進化上非常保守，主要包括軸絲、基體、過渡區(qū)、纖毛膜和基??質(zhì)幾個部分ｔｌ９’２°］。纖毛內(nèi)沒有合成蛋白質(zhì)的體系，這些蛋白質(zhì)在胞質(zhì)中合成，依??靠纖毛內(nèi)運輸（ＥＦＴ）系統(tǒng)，沿著軸絲微管運輸?shù)嚼w毛中，同時ＥＦＴ將代謝廢物等??運出纖毛，完成纖毛的組裝和維持％?２１］。ＩＦＴ復(fù)合體分為ＩＦＴ－Ａ和ＩＦＴ－Ｂ兩??種復(fù)合體，目前研宄認(rèn)為，ＩＦＴ－Ｂ復(fù)合體可能在與正向分子馬達結(jié)合的同時，與??軸絲前體蛋白相結(jié)合，將其運入纖毛，而ＥＦＴ－Ａ復(fù)合體與反向分子馬達結(jié)合，??將纖毛內(nèi)的蛋白運出纖毛［２２］。??１．２纖毛的基本功能??根據(jù)有無中央微管，我們可將纖毛分為“９＋２”型的動纖毛和”９＋０”型的原??纖毛

２．?３．１?ｐＬＫＯ．?１?載體??ｐＬＫＯ．?１為ＴＲＣ?（ｔｈｅ?ＲＮＡｉ?Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）組織建立的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，??能夠持續(xù)表達ｓｈＲＮＡ，載體圖譜如圖２所示。??ｓｈＲＮＡ??Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ??Ｕ６?ｃＰＰＴ??〇?ｐＬＫＯ．１?ｐｕｒｏ?ｆｔｓｉｎ３＇ＬＴＲ??５?ＬＴＲＵ?ｗｉｔｈ?ｓｈＲＮＡ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ?＇??７．０９１?ｂｐ??ｐＵＣ??Ａｍｐ?Ｒ??圖２：ｐＬＫＯ．?１載體圖譜??２．３．２?ｓｈＲＮＡ載體構(gòu)建??向ＴＲＣ公司提交ＩＦＴ８８基因序列得到一系列備選序列，篩選得分較高的序??列添加到〇ｌｉｇ〇中，〇ｌｉｇ〇引物列表如表１所不??１２??

搜樂苣は赴?鮒澈統(tǒng)曬竅蚍只?案兄?慚沽Φ撓跋歟崳?１?ｈＰＤＬＣｓ存在初級纖毛??如圖３所示，ｈＰＤＬＣｓ存在初級纖毛（乙�；簦酰猓酰欤椋顦�(biāo)記初級纖毛），共統(tǒng)??計５個樣本，每個樣本于２０倍鏡頭下隨機選取５個視野，依次統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)和初??級纖毛個數(shù)，得出纖毛率。纖毛率為６０．２７±１．８３％。??圖３：免疫熒光顯示初級纖毛：乙�；簦酰猓酰欤椋睿ňG色熒光）和ＤＡＰＩ?（藍色熒光）的??定位，白色箭頭指示部分初級纖毛。（Ｂａｒ＝２５ｕｍ）??２檢測慢病毒感染后ｈＰＤＬＣｓ中ＩＦＴ８８表達的變化。??實驗分為兩組：ＮＣ組為感染無意序列組ｈＰＤＬＣｓ，?ｓｈ［ＦＴ８８組為感染帶有??ｓｈＩＦＴ８８序列的慢病毒的ｈＰＤＬＣｓ。ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果（圖４Ａ）顯示：與ＮＣ組相??比，ｓｈＩＦＴ８８組丨ＦＴ８８基因表達水平下調(diào)至０．?０２?（；？〈０．?０１）；?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ結(jié)果顯示??（圖４Ｂ）ｓｈＩＦＴ８８組幾乎檢測不到丨ＦＴ８８，表達量明顯低于ＮＣ組。說明慢病毒感??染后ＩＦＴ８８基因沉默效果明顯。??Ａ?Ｂ??１．２?ｒ??－??４＜ｊ￡?ｚ?Ｈ??麵義〇．４?．?■麵邏嚇丁８８??７５??＊＊?５０?ｐ－ｔｕｂｕｌｉｎ??０．０１————??ＮＣ?ｓｈＩＦＴ８８??圖４：慢病毒感染ｈＰＤＬＣｓ后丨ＦＴ８８表達水平（Ａ）?ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測丨ＦＴ８８表達情況，??＊＊ｐ＜０．?０１；?（Ｂ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?檢測?ＩＦＴ８８?表達情況。??２１??
【參考文獻】

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本文編號：2838370