目的： 體外觀察白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜生長動力學特點；體外測定柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌的最低抑菌濃度及其對兩種念珠菌生物膜形成不同階段的MIC50，探討柴胡皂苷D在微克濃度水平對兩種念珠菌生物膜形成后的抑菌效果，為臨床篩選抗真菌藥物提供一定的理論依據。 方法： 第一部分：分別將標準株白念珠菌ATCC32354和熱帶念珠菌CBS94活化后稀釋成濃度為1×106/ml的菌懸液并以100μl/孔接種到96孔微量培養(yǎng)板中，用MTT分析法分別測定在接種后3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h的念珠菌生物活性并分別繪制白念珠菌和熱帶念珠菌生長曲線。 第二部分：分別將已活化的白念珠菌和熱帶念珠菌稀釋后，振蕩器上振蕩15s后用血球細胞計數板調節(jié)其濃度至1×10~5～5×10~5/ml，用真菌RPMI1640培養(yǎng)基按1：100稀釋成菌濃度為1×10~3～5×10~3/ml，采用微量稀釋法測定柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌的最低抑菌濃度（MIC80）。使用96孔微量培養(yǎng)板設定8個濃度，同時以只加對應菌懸液及真菌RPMI1640培養(yǎng)液各100μl作為陽性對照，只加真菌RPMI1640培養(yǎng)液200μl/孔作為空白孔調零。 第三部分：分別將標準株白念珠菌和熱帶念珠菌活化后稀釋成濃度為1×106/ml的菌懸液，以100μl/孔接種到96孔微量培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后棄去原培養(yǎng)液，并用PBS輕柔洗去游離的菌細胞，每孔加入100μl新鮮真菌RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24h更換一次新鮮真菌RPMI1640培養(yǎng)液。分別在接種后3h、6h、12h、24h、72h取出對應培養(yǎng)板棄去最后培養(yǎng)液，加入濃度為1280μg/ml～10μg/ml的柴胡皂苷D繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，采用MTT法分別測定兩種念珠菌在以上各時間點的念珠菌活性并繪制曲線，選取柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌的50%抑菌濃度（MIC50）進行分析比較。使用96孔微量培養(yǎng)板設定8個濃度，同時以只加對應菌懸液100μl/孔作為陽性對照，只加真菌RPMI1640培養(yǎng)液100μl/孔作為空白孔調零。 結果： 第一部分：白念組和熱帶組在3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h各時間點上兩者生物膜形成能力具有顯著性差異，P0.05差異有統(tǒng)計學意義。白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜活性增強與培養(yǎng)時間呈依賴性。白念珠菌在培養(yǎng)前24h生物膜活性增加最為明顯，在培養(yǎng)48h之后生物膜活性維持在相對較高水平的平臺期不再有明顯的增長；熱帶念珠菌在培養(yǎng)前6h生物膜活性增加明顯，在培養(yǎng)6h之后生物膜活性維持在相對較低水平的平臺期不再有明顯的增長。體外培養(yǎng)白念珠菌生物膜形成能力較熱帶念珠菌強。 第二部分：用MTT顯示色后酶標儀測得柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌MIC80分別為80μg/ml和320μg/ml與肉眼觀察判斷結果相符。 第三部分：柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜形成的抑制作用隨成膜時間的延長而減弱，通過柴胡皂苷D對兩種念珠菌50%抑菌濃度比較發(fā)現，柴胡皂苷D在3h、6h、12h、24h、72h各時間點上對白念珠菌生物膜的抑制作用明顯強于其對熱帶念珠菌生物膜的抑制作用，P0.05差異有統(tǒng)計學意義。柴胡皂苷D對熱帶念珠菌生物膜的50%抑菌濃度在72h時已經超過了微克濃度水平。 結論： 1．白念珠菌與熱帶念珠菌均能在96孔板中形成生物膜，生物膜形成后均能維持在相對較高水平，白念珠菌形成生物膜能力較熱帶念珠菌強。 2．柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌生長均有明顯的抑制作用，其對白念珠菌的抑制作用較熱帶念珠菌強。柴胡皂苷D對兩種念珠菌的最低抑菌濃度分別為80μg/ml和320μg/ml，柴胡皂苷D在念珠菌治療方面具有進一步研究開發(fā)的價值。 3．柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜形成均有不同程度抑制作用，柴胡皂苷D抑制白念珠菌生物膜形成能力強于其抑制熱帶念珠菌生物膜形成能力。
【學位單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R781.54;R285
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜的培養(yǎng)及生長動力學測定
    材料和方法
    結果
    討論
第二部分 柴胡皂苷 D 對白念珠菌和熱帶念珠菌 MIC80的測定
    材料和方法
    結果
    討論
第三部分 柴胡皂苷D對白念珠菌和熱帶念珠菌生物膜形成抑制作用研究
    材料和方法
    結果
    討論
結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2837551