當(dāng)前位置：主頁(yè) > 醫(yī)學(xué)論文 > 口腔論文 >

卵黃免疫球蛋白IgY改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牙周炎和口臭的研究

發(fā)布時(shí)間：2020-10-11 11:28

　　 IgY(Immunoglobulin of Yolk,IgY)是卵生動(dòng)物主要免疫球蛋白,功能上等同于哺乳動(dòng)物進(jìn)化上的高級(jí)IgG,卵生動(dòng)物IgY通過(guò)卵黃傳輸至胚胎,成為保護(hù)胚胎不受外界病原菌侵襲的抗體。雞抗體IgY的收集和分離快速而經(jīng)濟(jì),母雞經(jīng)特定微生物免疫后,從免疫母雞的蛋黃中能獲得效價(jià)高而持久的IgY抗體,被應(yīng)用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫檢驗(yàn)。基于免疫球蛋白IgY的體內(nèi)外功效作用,發(fā)現(xiàn)特異性IgY改善口腔厭氧致病菌(Porphyromonas gingivalis,Prevotella intermedius和Fusobacterium nucleatum)感染的大鼠牙周炎和口臭的典型癥狀,闡明IgY治療口腔疾病的作用。1.免疫球蛋白IgY的制備和生物化學(xué)特性。P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum菌液加入甲醛和弗氏佐劑,制成滅活疫苗,分3次免疫優(yōu)質(zhì)來(lái)杭蛋雞(Leghorn),收集雞蛋,分離蛋黃,采用0.01 mol/L pH5.0的醋酸緩沖液充分?jǐn)嚢?4℃冷藏沉降脂質(zhì)物質(zhì),離心后收集上清液,采用100 kDa孔徑透析進(jìn)行濃縮,獲得IgY,經(jīng)真空冷凍干燥和ELISA效價(jià)檢測(cè),其含量為360 mmol/L,對(duì)P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum的效價(jià)分別為1:25600、1:12800和1:25600。SDS-PAGE顯示IgY的分子量180 kDa,由兩條重鏈(67-70 kDa)和兩條輕鏈(25kDa)組成。2.免疫球蛋白IgY作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫特性。以IgY作為體外入侵抗原,檢測(cè)Wistar大鼠血液中CD4~+和CD8~+的數(shù)量和比值,免疫調(diào)節(jié)因子組胺、IgM、IgE和IgG等的變化,分析IgY可能引起的Wistar大鼠的免疫應(yīng)答,新西蘭兔的皮膚刺激和豚鼠的皮膚變態(tài)反應(yīng),評(píng)價(jià)樣品的急性、多次皮膚刺激和皮膚變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度,評(píng)價(jià)IgY對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫作用特性。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠體重和進(jìn)食量均無(wú)顯著變化,組胺和IgM在第9天顯著升高后恢復(fù)正常水平,IgG和IgE基本無(wú)變化,CD4~+和CD8~+細(xì)胞數(shù)量分別為1902.60和974.00、免疫細(xì)胞中占比為54.36%和27.83%,CD4~+/CD8~+比值為1.95,都顯著低于陽(yáng)性對(duì)照(p0.05),且在正常范圍內(nèi)。皮膚刺激試驗(yàn)急性1-72 h、慢性1-14 d均無(wú)刺激,皮膚變態(tài)試驗(yàn)激發(fā)后24 h和48 h有2例積分2的動(dòng)物,屬于微弱變態(tài)反應(yīng)。免疫應(yīng)答、皮膚刺激和皮膚變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明IgY不會(huì)引起大鼠的免疫應(yīng)答,對(duì)新西蘭兔皮膚無(wú)刺激性,對(duì)豚鼠皮膚有微弱的變態(tài)反應(yīng),當(dāng)IgY的含量降低時(shí)其皮膚變態(tài)反應(yīng)將得到有效控制,表明IgY作為外來(lái)抗原對(duì)機(jī)體無(wú)致敏性。3.免疫球蛋白IgY治療大鼠牙周炎的功效。用口腔厭氧致病菌P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum建立大鼠牙周炎動(dòng)物模型,給藥期間,每周探針檢測(cè)并記錄牙齦指數(shù)(GI)、菌斑指數(shù)(PI)和探診出血指數(shù)(BOP),ELISA試劑盒測(cè)定血液中IL-6和TNF-α的含量,取組織固定,采集X射線標(biāo)本數(shù)碼照片,觀察牙槽骨吸收情況,制作病理切片,觀察牙周組織的病理變化情況。結(jié)果顯示給藥后GI、PI和BOP的分?jǐn)?shù)分別降低90.00%、81.82%和100.00%,血液中IL-6和TNF-α的濃度降低63.04%和54.05%,與對(duì)照組相比,特異性IgY能夠顯著降低(p0.05)GI、PI和BOP指數(shù),有效改善牙齦炎癥、菌群共聚和牙周組織出血等癥狀,緩解牙周炎大鼠牙周組織病變,并可促進(jìn)新牙周纖維及新骨的生成,減輕因牙周炎造成的炎癥應(yīng)答,表明IgY對(duì)口腔致病菌介導(dǎo)的牙周炎有顯著的預(yù)防和治療作用。4.免疫球蛋白IgY對(duì)口臭動(dòng)物模型的影響�；诳诔舻陌l(fā)病機(jī)理,采用P.gingivalis、P.intermedius和F.nucleatum誘導(dǎo),飲用蔗糖水促進(jìn)口腔厭氧致病菌定植的方式,制備大鼠口臭模型,給藥IgY,檢測(cè)GI、PI和口臭指數(shù)(HI)的變化,頂空固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GCMS)發(fā)現(xiàn)大鼠口臭模型的口腔中厭氧致病菌代謝物的種類和含量變化,ELISA試劑盒檢測(cè)血液中IL-6和TNF-α水平。結(jié)果顯示,口腔中厭氧致病菌代謝物,主要由醛類、酮類、羧酸類和含氮化合物類組成,給藥后GI、PI和HI的評(píng)分減少55.67%、57.14%和50.00%,血液中IL-6和TNF-α的濃度降低74.44%和85.09%,口腔中厭氧致病菌代謝物變化最大的有正己醛、2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、乙酸、正己酸、氨和乙烯基異丙基醚,相對(duì)含量分別降低8.84%、7.84%、8.11%、11.24%、8.51%和12.00%,且高劑量降低的百分比大于低劑量,表明特異性IgY能有效緩解由口腔厭氧致病菌引起的口腔健康問(wèn)題和代謝物產(chǎn)生的異味,對(duì)口腔厭氧致病菌介導(dǎo)的口臭具有預(yù)防和治療的功效。5.免疫球蛋白IgY抑制口腔厭氧致病菌增殖特性的研究。以人工唾液為培養(yǎng)基,模擬在口腔環(huán)境中不同劑量IgY對(duì)P.gingivalis、P.intermedius和F.nucleatum三種口腔厭氧致病菌以及組合菌液的增殖抑制作用,氣味掃描儀(E-Nose)對(duì)人工唾液模擬體系中氣味輪廓成分進(jìn)行主成分分析,GCMS分析人工唾液模擬體系中口腔厭氧致病菌的代謝產(chǎn)物揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)的種類以及含量變化,Halimeter檢測(cè)人工唾液模擬體系中口腔厭氧致病菌的代謝產(chǎn)物揮發(fā)性硫化物(VSCs)的含量變化。結(jié)果顯示P.gingivalis在人工唾液中呈S型生長(zhǎng)曲線,HI指數(shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì);添加三種劑量IgY后,能夠有效抑制口腔厭氧致病菌在人工唾液模擬體系中的增殖,尤其是高劑量IgY在6 h可顯著抑制(p0.05)口腔厭氧致病菌的生長(zhǎng)繁殖;氣味掃描儀對(duì)人工唾液模擬體系中氣味輪廓成分主成分分析顯示IgY給藥組能與對(duì)照組顯著區(qū)分,且具有濃度依賴性,VOCs的種類有酮類、羧酸類、酯類、芳香族和含氮化合物,其中2,4-二叔丁基苯酚、1,4-二氧代全氫吡咯并[1,2-a]吡嗪、反式芥酸酰胺、5-氯-3-溴-1-[(4-甲基苯基)磺�；鵠-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶和十一烷變化量最大,分別降低1.01%、1.43%、1.13%、0.94%、1.15%、0.72%,不同劑量給藥組的VSCs的含量比對(duì)照組降低16~44%,表明人工唾液模擬體系中氣味成分發(fā)生了明顯的變化,特異性IgY有效降低口腔厭氧致病菌中VSCs和VOCs的產(chǎn)量,通過(guò)抑制口腔厭氧致病菌的增殖,降低致病菌代謝物的產(chǎn)生,緩解由代謝物引起的口腔炎癥和異味,阻斷口腔疾病的發(fā)生。比較IgY與魚精蛋白、乳鐵蛋白和甲硝唑3種抑菌劑的抑菌作用,結(jié)果顯示高濃度的IgY對(duì)P.gingivalis和F.nucleatum的增殖有顯著的抑制,而高濃度的乳鐵蛋白對(duì)P.intermedius的增殖有顯著的抑制,但當(dāng)濃度降低后,中低濃度的IgY對(duì)P.intermedius增殖的抑制能力明顯大于中低濃度的乳鐵蛋白,表明IgY的抑菌能力更加出眾。響應(yīng)面法優(yōu)化IgY對(duì)口腔厭氧致病菌的抑制,結(jié)果顯示IgY在165-181mmol/L的劑量下能夠最大限度抑制口腔厭氧致病菌的增殖和代謝物的產(chǎn)生。母雞經(jīng)特定微生物免疫后,產(chǎn)生特異性抗體IgY,濃縮和聚集在蛋黃中,收集雞蛋,提取純化IgY,含量高,特異性強(qiáng),對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有刺激和過(guò)敏反應(yīng),作用于牙周炎和口臭動(dòng)物模型,能明顯改善牙周炎和口臭的典型癥狀,體外人工唾液模擬體系中特異性的抑制三種口腔致病菌的增殖和代謝物的釋放,免疫球蛋白IgY通過(guò)抑制口腔厭氧致病菌增殖治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牙周炎和口臭等口腔疾病。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.42;R781.9
【部分圖文】：