背景:生物學(xué)成像主要是對(duì)機(jī)體進(jìn)行不同層次細(xì)胞、組織和分子水平的研究,它以能激發(fā)出熒光信號(hào)為基礎(chǔ)。熒光成像已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的許多領(lǐng)域,由于其具有反應(yīng)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉易得等優(yōu)點(diǎn)已成為人們理解生命發(fā)展過程、細(xì)胞生理生態(tài)結(jié)構(gòu)中一種必不可少的研究手段。選擇適宜的造影劑對(duì)生物學(xué)成像來說是具有重要的參考價(jià)值。隨著科學(xué)社會(huì)的快速發(fā)展,各種結(jié)構(gòu)性能優(yōu)異的熒光染色劑逐漸被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行研究,從最開始的有機(jī)小分子熒光染料到熒光標(biāo)記蛋白,再到半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳納米材料等經(jīng)過了一系列發(fā)展變化,隨著探索的發(fā)展過程,熒光染料的功能結(jié)構(gòu)也越來越好。有機(jī)小分子熒光染料的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)機(jī)體的干擾極小,缺點(diǎn)在于其使用時(shí)間過短利用率低,雙色或者多色熒光不能同時(shí)標(biāo)記,對(duì)生物體具有損傷作用主要是由于其光解后的產(chǎn)物所引起的,在使用過程中遇到強(qiáng)光也容易漂白,因此難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)多色和無損傷的研究。半導(dǎo)體量子點(diǎn)比熒光染料可以承受多次光發(fā)射和激發(fā)、具有發(fā)射光譜窄和激發(fā)譜光寬等優(yōu)勢(shì),缺點(diǎn)在于量子點(diǎn)中含有重金屬離子,其對(duì)生物體和環(huán)境會(huì)造成很大的毒性。因此,如何開發(fā)和研制一種毒性小、能夠多色成像的新型納米材料將具有重要的意義。碳點(diǎn)作為一種可以激發(fā)出熒光的新型納米材料,具有很高的抗漂白穩(wěn)定性、吸收和發(fā)射譜寬而且可調(diào)、良好的生物安全性和低生物毒性,正是由于這些特點(diǎn)使其受到大批學(xué)者們的親睞和探索興趣。熒光碳點(diǎn)的低毒性和光穩(wěn)定性,使其能夠完全取代含有重金屬的傳統(tǒng)量子點(diǎn),這些特性使碳點(diǎn)已成為最有希望的發(fā)光材料之一。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),熒光碳點(diǎn)可以呈現(xiàn)多色熒光當(dāng)其在不同的激發(fā)波長(zhǎng)狀態(tài)下,主要是由于熒光碳點(diǎn)表面官能團(tuán)中含有羥基,羥基對(duì)細(xì)胞壁的親和力很高,加之碳點(diǎn)材料的尺寸小和穿透性強(qiáng),能夠很快吸附到細(xì)胞膜上,由于碳點(diǎn)材料具有多色熒光從而使細(xì)胞可以呈現(xiàn)不同顏色的熒光。且熒光碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)菌后使細(xì)菌具有不同的熒光特性,以此來鑒別細(xì)菌。鑒于以上研究,本實(shí)驗(yàn)通過水熱法制備色氨酸碳點(diǎn),標(biāo)記不同種類的成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞及不同種類的細(xì)菌,共聚焦下觀察不同細(xì)胞和細(xì)菌的成像特征,為利用該碳點(diǎn)探討不同細(xì)胞的生理形態(tài)和結(jié)構(gòu)及鑒別不同種類的細(xì)菌具有重要的意義。方法:1.色氨酸碳點(diǎn)的制備采用經(jīng)典的水熱法(hydrothermal method),制備色氨酸碳點(diǎn),并進(jìn)行相關(guān)性能表征。2.色氨酸碳點(diǎn)的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)將MC3T3-E1(小鼠前成骨細(xì)胞系)、RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞系)、L929(小鼠成纖維細(xì)胞系)細(xì)胞分別在各自適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)在無菌96孔板,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組,以及不同濃度色氨酸碳點(diǎn)溶液稀釋液組(10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)、400μg.ml~(-1)、600μg.ml~(-1)),培養(yǎng)24h后,采用MTT比色法檢測(cè)色氨酸碳點(diǎn)對(duì)三種細(xì)胞的各自細(xì)胞毒性。3.色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記不同細(xì)胞的生物成像觀察將本實(shí)驗(yàn)選擇的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞分別與最佳濃度的色氨酸碳點(diǎn)溶液共培養(yǎng)24h后,激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察色氨酸碳點(diǎn)對(duì)此三種不同細(xì)胞在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的成像結(jié)果。4.色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記不同細(xì)菌的生物成像觀察選擇大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923),分別與不同濃度的色氨酸碳點(diǎn)溶液共培養(yǎng)24h后,通過結(jié)合曲線以測(cè)定最佳細(xì)菌成像的色氨酸碳點(diǎn)濃度和細(xì)菌濃度,應(yīng)用熒光光譜儀測(cè)定不同種類細(xì)菌的光譜學(xué)特性,激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察不同細(xì)菌在色氨酸碳點(diǎn)受不同激發(fā)波長(zhǎng)和熒光閾值條件下成像效果。結(jié)果:1.制備的色氨酸碳點(diǎn)水溶液外觀呈深藍(lán)色,大量稀釋后呈無色。透射電子顯微鏡觀察表明制備的色氨酸碳點(diǎn)為球形顆粒,粒徑大小分布均勻,分散度較好,直徑大小約為3.35nm;傅立葉紅外光譜結(jié)果表明制備的色氨酸碳點(diǎn)保留了色氨酸中羧基、氨基等官能團(tuán),這些基團(tuán)使碳點(diǎn)具有較好的分散性和水溶性。色氨酸碳點(diǎn)的光譜結(jié)果表明色氨酸碳點(diǎn)具有多對(duì)發(fā)射和激發(fā)光譜,可以表現(xiàn)激發(fā)依賴性。2.MTT檢測(cè)結(jié)果色氨酸碳點(diǎn)的體外MTT結(jié)果顯示當(dāng)色氨酸碳點(diǎn)濃度為0μg.ml~(-1)、10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)組細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果均為1級(jí),均在正常生物安全范圍內(nèi);色氨酸碳點(diǎn)濃度為400μg.ml~(-1)時(shí)隨著濃度的不斷增加,細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)出低細(xì)胞毒性。3.細(xì)胞成像觀察結(jié)果將RAW264.7、MC3T3-E1、L929三種細(xì)胞分別與色氨酸碳點(diǎn)共培養(yǎng)后,RAW264.7細(xì)胞呈橢圓形或圓形,細(xì)胞形態(tài)較小成團(tuán)或成堆聚集。MC3T3-E1細(xì)胞體積較大可以是RAW264.7細(xì)胞的好幾倍,細(xì)胞核大且形態(tài)圓整,整個(gè)細(xì)胞形態(tài)可呈梭形、錐形或者短梭形。L929細(xì)胞體積較大呈長(zhǎng)梭形,具有突起。隨著色氨酸碳點(diǎn)激發(fā)波長(zhǎng)的改變,本實(shí)驗(yàn)選擇的三種細(xì)胞在共聚焦熒光顯微鏡下觀察均可以出現(xiàn)不同顏色的熒光。RAW264.7和L929細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)為主要熒光聚集區(qū)域,而MC3T3-E1細(xì)胞則不同其整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)都具有熒光,細(xì)胞成像后熒光信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定且細(xì)胞大致輪廓清楚,說明色氨酸碳點(diǎn)的細(xì)胞成像效果好。4.細(xì)菌生物學(xué)成像觀察結(jié)果4.1在體外不同細(xì)菌與色氨酸碳點(diǎn)溶液共培養(yǎng)后測(cè)定的最佳結(jié)合曲線時(shí)色氨酸碳點(diǎn)和細(xì)菌的濃度分別是400μg.ml~(-1)和1×10~8 CFU.ml~(-1)。4.2熒光光譜儀檢測(cè)結(jié)果顯示,在300nm~700nm激發(fā)波長(zhǎng)下,色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記金黃色葡萄球菌的熒光強(qiáng)度閾值比色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記大腸桿菌的熒光強(qiáng)度閾值范圍大。4.3不同細(xì)菌和色氨酸碳點(diǎn)在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果顯示,在激發(fā)波長(zhǎng)548nm下大腸桿菌成紅色熒光圖像、激發(fā)波長(zhǎng)488nm時(shí)大腸桿菌成綠色熒光圖像,金黃色葡萄球菌也可成綠色和紅色熒光圖像,但當(dāng)設(shè)置熒光強(qiáng)度閾值高于色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記大腸桿菌的熒光強(qiáng)度閾值范圍且低于色氨酸碳點(diǎn)標(biāo)記金黃色葡萄球的最大熒光強(qiáng)度閾值時(shí),此時(shí)的熒光圖像只能見到金黃色葡萄球菌,以此方法來鑒別大腸桿菌和金黃色鏈球菌。結(jié)論:1.應(yīng)用水熱法成功制備了色氨酸碳點(diǎn),合成工藝操作簡(jiǎn)單易行;2.制備的色氨酸碳點(diǎn)熒光性能優(yōu)異,生物安全性好;3.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,制備的色氨酸碳點(diǎn)能成功標(biāo)記細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)完整且光學(xué)性能穩(wěn)定,說明色氨酸碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞成像效果好4.體外細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí),色氨酸碳點(diǎn)能夠成功標(biāo)記細(xì)菌且細(xì)菌形態(tài)良好,并且能夠從形態(tài)學(xué)和熒光特性上檢測(cè)和鑒定細(xì)菌,表明色氨酸碳點(diǎn)對(duì)細(xì)菌具有較好的生物學(xué)成像效果。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

圖 3.3 色氨酸碳點(diǎn)的 TEM 粒徑分布圖 圖 3.4 色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜結(jié)果3.1.2 色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜結(jié)果如圖 3.4 所示色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜圖是以激發(fā)波長(zhǎng)(nm)為橫坐標(biāo), 熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的曲線圖， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

圖 3.3 色氨酸碳點(diǎn)的 TEM 粒徑分布圖 圖 3.4 色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜結(jié)果3.1.2 色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜結(jié)果如圖 3.4 所示色氨酸碳點(diǎn)的熒光光譜圖是以激發(fā)波長(zhǎng)(nm)為橫坐標(biāo), 熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的曲線圖， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

圖 3.5 色氨酸碳點(diǎn)的 UV-vis 結(jié)果 圖 3.6 色氨酸碳點(diǎn)的 FT-IR 結(jié)果3.1.3 色氨酸碳點(diǎn)的紫外可見吸收光譜結(jié)果色氨酸碳點(diǎn)的紫外可見吸收光譜是以發(fā)射波長(zhǎng)（nm）為橫坐標(biāo)，吸光度縱坐標(biāo)的曲線圖（見圖 3.5）。其是一條平滑的坡狀曲線,由圖 3.5 可見，色氨

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本文編號(hào)：2832783