背景:生物學成像主要是對機體進行不同層次細胞、組織和分子水平的研究,它以能激發(fā)出熒光信號為基礎。熒光成像已廣泛應用于科學研究的許多領域,由于其具有反應靈敏度高、操作簡單、價格低廉易得等優(yōu)點已成為人們理解生命發(fā)展過程、細胞生理生態(tài)結(jié)構(gòu)中一種必不可少的研究手段。選擇適宜的造影劑對生物學成像來說是具有重要的參考價值。隨著科學社會的快速發(fā)展,各種結(jié)構(gòu)性能優(yōu)異的熒光染色劑逐漸被發(fā)現(xiàn)并進行研究,從最開始的有機小分子熒光染料到熒光標記蛋白,再到半導體量子點、碳納米材料等經(jīng)過了一系列發(fā)展變化,隨著探索的發(fā)展過程,熒光染料的功能結(jié)構(gòu)也越來越好。有機小分子熒光染料的優(yōu)點在于其對機體的干擾極小,缺點在于其使用時間過短利用率低,雙色或者多色熒光不能同時標記,對生物體具有損傷作用主要是由于其光解后的產(chǎn)物所引起的,在使用過程中遇到強光也容易漂白,因此難以實現(xiàn)同時多色和無損傷的研究。半導體量子點比熒光染料可以承受多次光發(fā)射和激發(fā)、具有發(fā)射光譜窄和激發(fā)譜光寬等優(yōu)勢,缺點在于量子點中含有重金屬離子,其對生物體和環(huán)境會造成很大的毒性。因此,如何開發(fā)和研制一種毒性小、能夠多色成像的新型納米材料將具有重要的意義。碳點作為一種可以激發(fā)出熒光的新型納米材料,具有很高的抗漂白穩(wěn)定性、吸收和發(fā)射譜寬而且可調(diào)、良好的生物安全性和低生物毒性,正是由于這些特點使其受到大批學者們的親睞和探索興趣。熒光碳點的低毒性和光穩(wěn)定性,使其能夠完全取代含有重金屬的傳統(tǒng)量子點,這些特性使碳點已成為最有希望的發(fā)光材料之一。有學者研究發(fā)現(xiàn),熒光碳點可以呈現(xiàn)多色熒光當其在不同的激發(fā)波長狀態(tài)下,主要是由于熒光碳點表面官能團中含有羥基,羥基對細胞壁的親和力很高,加之碳點材料的尺寸小和穿透性強,能夠很快吸附到細胞膜上,由于碳點材料具有多色熒光從而使細胞可以呈現(xiàn)不同顏色的熒光。且熒光碳點進入細菌后使細菌具有不同的熒光特性,以此來鑒別細菌。鑒于以上研究,本實驗通過水熱法制備色氨酸碳點,標記不同種類的成骨細胞、成纖維細胞和破骨細胞及不同種類的細菌,共聚焦下觀察不同細胞和細菌的成像特征,為利用該碳點探討不同細胞的生理形態(tài)和結(jié)構(gòu)及鑒別不同種類的細菌具有重要的意義。方法:1.色氨酸碳點的制備采用經(jīng)典的水熱法(hydrothermal method),制備色氨酸碳點,并進行相關(guān)性能表征。2.色氨酸碳點的體外細胞毒性評價將MC3T3-E1(小鼠前成骨細胞系)、RAW264.7(小鼠單核巨噬細胞系)、L929(小鼠成纖維細胞系)細胞分別在各自適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)在無菌96孔板,實驗分為空白對照組,以及不同濃度色氨酸碳點溶液稀釋液組(10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)、400μg.ml~(-1)、600μg.ml~(-1)),培養(yǎng)24h后,采用MTT比色法檢測色氨酸碳點對三種細胞的各自細胞毒性。3.色氨酸碳點標記不同細胞的生物成像觀察將本實驗選擇的處于對數(shù)生長期的三種細胞分別與最佳濃度的色氨酸碳點溶液共培養(yǎng)24h后,激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察色氨酸碳點對此三種不同細胞在不同激發(fā)波長下的成像結(jié)果。4.色氨酸碳點標記不同細菌的生物成像觀察選擇大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923),分別與不同濃度的色氨酸碳點溶液共培養(yǎng)24h后,通過結(jié)合曲線以測定最佳細菌成像的色氨酸碳點濃度和細菌濃度,應用熒光光譜儀測定不同種類細菌的光譜學特性,激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察不同細菌在色氨酸碳點受不同激發(fā)波長和熒光閾值條件下成像效果。結(jié)果:1.制備的色氨酸碳點水溶液外觀呈深藍色,大量稀釋后呈無色。透射電子顯微鏡觀察表明制備的色氨酸碳點為球形顆粒,粒徑大小分布均勻,分散度較好,直徑大小約為3.35nm;傅立葉紅外光譜結(jié)果表明制備的色氨酸碳點保留了色氨酸中羧基、氨基等官能團,這些基團使碳點具有較好的分散性和水溶性。色氨酸碳點的光譜結(jié)果表明色氨酸碳點具有多對發(fā)射和激發(fā)光譜,可以表現(xiàn)激發(fā)依賴性。2.MTT檢測結(jié)果色氨酸碳點的體外MTT結(jié)果顯示當色氨酸碳點濃度為0μg.ml~(-1)、10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)組細胞毒性測試結(jié)果均為1級,均在正常生物安全范圍內(nèi);色氨酸碳點濃度為400μg.ml~(-1)時隨著濃度的不斷增加,細胞逐漸呈現(xiàn)出低細胞毒性。3.細胞成像觀察結(jié)果將RAW264.7、MC3T3-E1、L929三種細胞分別與色氨酸碳點共培養(yǎng)后,RAW264.7細胞呈橢圓形或圓形,細胞形態(tài)較小成團或成堆聚集。MC3T3-E1細胞體積較大可以是RAW264.7細胞的好幾倍,細胞核大且形態(tài)圓整,整個細胞形態(tài)可呈梭形、錐形或者短梭形。L929細胞體積較大呈長梭形,具有突起。隨著色氨酸碳點激發(fā)波長的改變,本實驗選擇的三種細胞在共聚焦熒光顯微鏡下觀察均可以出現(xiàn)不同顏色的熒光。RAW264.7和L929細胞的細胞膜和細胞質(zhì)為主要熒光聚集區(qū)域,而MC3T3-E1細胞則不同其整個細胞結(jié)構(gòu)都具有熒光,細胞成像后熒光信號強度穩(wěn)定且細胞大致輪廓清楚,說明色氨酸碳點的細胞成像效果好。4.細菌生物學成像觀察結(jié)果4.1在體外不同細菌與色氨酸碳點溶液共培養(yǎng)后測定的最佳結(jié)合曲線時色氨酸碳點和細菌的濃度分別是400μg.ml~(-1)和1×10~8 CFU.ml~(-1)。4.2熒光光譜儀檢測結(jié)果顯示,在300nm~700nm激發(fā)波長下,色氨酸碳點標記金黃色葡萄球菌的熒光強度閾值比色氨酸碳點標記大腸桿菌的熒光強度閾值范圍大。4.3不同細菌和色氨酸碳點在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下檢測結(jié)果顯示,在激發(fā)波長548nm下大腸桿菌成紅色熒光圖像、激發(fā)波長488nm時大腸桿菌成綠色熒光圖像,金黃色葡萄球菌也可成綠色和紅色熒光圖像,但當設置熒光強度閾值高于色氨酸碳點標記大腸桿菌的熒光強度閾值范圍且低于色氨酸碳點標記金黃色葡萄球的最大熒光強度閾值時,此時的熒光圖像只能見到金黃色葡萄球菌,以此方法來鑒別大腸桿菌和金黃色鏈球菌。結(jié)論:1.應用水熱法成功制備了色氨酸碳點,合成工藝操作簡單易行;2.制備的色氨酸碳點熒光性能優(yōu)異,生物安全性好;3.在體外細胞實驗中,制備的色氨酸碳點能成功標記細胞,細胞形態(tài)完整且光學性能穩(wěn)定,說明色氨酸碳點對細胞成像效果好4.體外細菌實驗時,色氨酸碳點能夠成功標記細菌且細菌形態(tài)良好,并且能夠從形態(tài)學和熒光特性上檢測和鑒定細菌,表明色氨酸碳點對細菌具有較好的生物學成像效果。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

圖 3.3 色氨酸碳點的 TEM 粒徑分布圖 圖 3.4 色氨酸碳點的熒光光譜結(jié)果3.1.2 色氨酸碳點的熒光光譜結(jié)果如圖 3.4 所示色氨酸碳點的熒光光譜圖是以激發(fā)波長(nm)為橫坐標, 熒光強度為縱坐標的曲線圖， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

圖 3.3 色氨酸碳點的 TEM 粒徑分布圖 圖 3.4 色氨酸碳點的熒光光譜結(jié)果3.1.2 色氨酸碳點的熒光光譜結(jié)果如圖 3.4 所示色氨酸碳點的熒光光譜圖是以激發(fā)波長(nm)為橫坐標, 熒光強度為縱坐標的曲線圖， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

圖 3.5 色氨酸碳點的 UV-vis 結(jié)果 圖 3.6 色氨酸碳點的 FT-IR 結(jié)果3.1.3 色氨酸碳點的紫外可見吸收光譜結(jié)果色氨酸碳點的紫外可見吸收光譜是以發(fā)射波長（nm）為橫坐標，吸光度縱坐標的曲線圖（見圖 3.5）。其是一條平滑的坡狀曲線,由圖 3.5 可見，色氨

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