目的： 分別構(gòu)建含人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）基因的真核表達(dá)載體和含人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growthfactor-β1，TGF-β1）基因的真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將這兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），探討bFGF與TGF-β1雙基因能否共同修飾BMSCs及對(duì)它的增殖是否具有協(xié)同作用，為聯(lián)合利用基因工程技術(shù)和牙周組織工程技術(shù)修復(fù)牙槽骨缺損提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 通過(guò)PCR方法從質(zhì)粒pDONR223-bFGF、pDONR223-TGF-β1中獲得人bFGF和人TGF-β1基因，將這兩種目的基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1，用酶切和測(cè)序的方法來(lái)鑒定重組真核表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，用流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物。將構(gòu)建成功的兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSCs，RT-PCR和Western blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)BMSCs中bFGF和TGF-β1基因的表達(dá)。通過(guò)MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況，各組光密度值（OD值）均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： （1）真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，電泳后顯示有468bp、1173bp的人bFGF和人TGF-β1目的基因片段及5428bp的線性化pcDNA3.1(+)載體片段。目的基因人bFGF的測(cè)序結(jié)果與經(jīng)過(guò)優(yōu)化的人bFGF基因堿基序列基本一致，人bFGF基因于447位有1個(gè)堿基突變：G→T，于467位有1個(gè)堿基突變：A→G，均為同義突變。目的基因人TGF-β1的測(cè)序結(jié)果與GenBank中的人TGF-β1基因堿基序列一致，無(wú)堿基突變。說(shuō)明構(gòu)建的真核表達(dá)載體中含有人bFGF和人TGF-β1基因。 （2）真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs24h后，通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)到bFGF、TGF-β1基因的表達(dá)，其蛋白分子量分別約為18kD和25kD。共轉(zhuǎn)染組中既有bFGF基因的表達(dá)也有TGF-β1基因的表達(dá)。 （3）真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs24h后，對(duì)各組MTT OD值進(jìn)行比較：pcDNA3.1(+)-bFGF組、pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、 pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、pcDNA3.1(+)組的OD值均高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-bFGF組、pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組的OD值均高于pcDNA3.1(+)組（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-bFGF組的OD值高于pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-TGF-β1組OD值與pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組的OD值比較，P＞0.05，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： （1）真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1構(gòu)建成功。 （2）真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1能夠在SD大鼠BMSCs中表達(dá)。bFGF與TGF-β1雙基因能夠共同修飾SD大鼠BMSCs。 （3）本實(shí)驗(yàn)中，bFGF和TGF-β1分別修飾SD大鼠BMSCs均可促進(jìn)其增殖。bFGF、TGF-β1雙基因共同修飾SD大鼠BMSCs對(duì)其增殖有促進(jìn)作用，但不具有協(xié)同作用。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)各組24h后MTTOD值

pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-TGF-β1 組與 pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 之間的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表十五 轉(zhuǎn)染各組與對(duì)照組 24h MTT 光密度值（OD490）（ x ± s）組別 n OD 值bFGF*10 0.453±0.040a,b,cTGF-β1*10 0.395±0.048a,b,dbFGF+TGF-β1*10 0.396±0.016a,bpcDNA3.1(+) 10 0.324±0.023a空白對(duì)照組 10 0.267±0.009*bFGF =pcDNA3.1(+)-bFGF 組；TGF-β1 =pcDNA3.1(+)-TGF-β1 組；bFGF+TGF-β1 =pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 組。a=P＜0.01 VS 空白對(duì)照組；b=P＜0.01 VS pcDNA3.1(+)組；c=P＜0.01 VS pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 組；d=P＞0.05 VS pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1組。

圖 1A BMSCs 原代培養(yǎng) 3d(×100) 圖 1B BMSCs 原代培養(yǎng) 5d(×100)圖 1C BMSCs 原代培養(yǎng) 7d(×100) 圖 1D BMSCs 傳代培養(yǎng) 2d(×100)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2832084