人涎腺黏液表皮樣癌(Mucoepidermoid Carcinoma,MEC)是涎腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤,約占涎腺惡性腫瘤的30%,盡管有時(shí)表現(xiàn)像良性病變,生長(zhǎng)比較慢,但是該腫瘤有時(shí)是高度惡性而且預(yù)后很差。低分化的涎腺黏液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),5年的存活率不超過(guò)43%。 對(duì)于BZAP45(或BZW1)基因的相關(guān)研究的文獻(xiàn)不多。至今僅知BZAP45是一種調(diào)節(jié)因子。而對(duì)于BZAP45基因是否有其他功能并沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道,也未見(jiàn)有BZAP45基因與腫瘤相關(guān)的報(bào)道。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)作用機(jī)制為應(yīng)用小的雙鏈RNA引發(fā)序列特異性的基因表達(dá)的“沉默”或“敲除”。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中這種雙鏈RNA可以是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (Small hairpin RNA,shRNA);也可以是3'-端帶有游離堿基的簡(jiǎn)單的二聚體(Small interference RNA, siRNA)。轉(zhuǎn)染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往時(shí)間比較短,而且局限于容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。應(yīng)用于RNA干擾的載體有很多種,而利用慢病毒構(gòu)建載體應(yīng)用于基因沉默,是研究基因功能很好的方法。 在本課題的前期研究中,我們初步發(fā)現(xiàn)在黏液表皮樣癌組織和細(xì)胞中,BZAP45均高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本課題構(gòu)建了BZAP45慢病毒干涉載體,將Mc3細(xì)胞中的BZAP45基因沉默,觀察其體外和體內(nèi)生物學(xué)特性的改變,并對(duì)其影響Mc3細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制進(jìn)行初步探索。本課題主要的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面: 1.進(jìn)一步確認(rèn)BZAP45基因在黏黏液表皮樣癌中高表達(dá) 為驗(yàn)證基因芯片結(jié)果正確與否并且明確BZAP45基因是否為黏液表皮樣癌特異性的差異表達(dá)基因,我們?cè)O(shè)計(jì)了BZAP45基因?qū)崟r(shí)定量PCR的引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè);并預(yù)制了BZAP45基因的多克隆抗體,對(duì)4例腫瘤組織(制備成15個(gè)樣本)和4例正常組織進(jìn)行了免疫組化染色。結(jié)果顯示,BZAP45基因在黏液表皮樣癌細(xì)胞和組織中表達(dá)均比正常細(xì)胞和組織高。 2. BZAP 45基因RNA干擾慢病毒載載體的制備及黏黏液液表皮樣癌細(xì)細(xì)胞胞感染 針對(duì)靶基因序列,利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)4個(gè)針對(duì)BZAP45基因的RNA干擾靶點(diǎn)序列;合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo,其兩端含酶切位點(diǎn)粘端,直接連入酶切后的載體上,將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆先進(jìn)行PCR鑒定,再進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后,鑒定陽(yáng)性的克隆即為構(gòu)建成功的BZAP45基因RNA干擾慢病毒載體。選擇干涉效果最好的序列,經(jīng)過(guò)病毒的小量包裝、大量包裝、滴度檢測(cè)及濃縮后獲得足夠滴度的慢病毒溶液,利用慢病毒載體感染Mc3細(xì)胞,利用有限稀釋法挑選陽(yáng)性單克隆,并利用時(shí)定量PCR對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,從而獲得了穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。 3. BZAP 45基因干涉后Mc3細(xì)胞體體體外外及及體體內(nèi)內(nèi)生生物物學(xué)學(xué)行為的改變 為了研究BZAP45基因在Mc3細(xì)胞中可能的作用,我們將BZAP45基因干涉,使其沉默后,利用MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)、HE染色、透射電鏡等方法察Mc3細(xì)胞體外的生物學(xué)行為的變化情況,利用裸鼠移植瘤方法觀察了Mc3細(xì)胞干涉前后在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,BZAP45基因沉默后,Mc3細(xì)胞體外增殖變緩,細(xì)胞的群體倍增時(shí)間由原來(lái)的約23 h增為約48 h;克隆形成能力下降,克隆形成率由原來(lái)的78%下降為20%;體外遷移能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細(xì)胞遷移的距離分別為65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667±3.066μm;體外侵襲能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細(xì)胞到達(dá)小室底面的細(xì)胞數(shù)分別為85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7個(gè);細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,干涉后細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、碎裂、邊集于核膜,呈境界清楚的塊狀或半月?tīng)?體內(nèi)成瘤速度變緩,抑瘤率約為57.95%。 4. BZAP 45影響MMCC 3細(xì)細(xì)細(xì)胞胞胞生生生物物物學(xué)學(xué)行行為為的的機(jī)機(jī)制初探為研究BZAP45影響MC3細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制,我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了干涉前后細(xì)胞周期分布的改變,并利用免疫熒光檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子以及細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)改變,結(jié)果顯示,BZAP45基因干涉后,細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯,干涉前后p53、c-myc和P21的表達(dá)無(wú)明顯變化;干涉后,caspase3的表達(dá)有所升高,而cyclin-D1和PCNA的表達(dá)有所降低。 結(jié)論: 1. BZAP45基因在黏液表皮樣癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。 2.成功構(gòu)建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉載體。并成功將MC3細(xì)胞的BZAP45基因干涉,獲得了穩(wěn)定的細(xì)胞株。 3. BZAP45基因被干涉后,Mc3細(xì)胞的體內(nèi)和體外的生物學(xué)特性發(fā)生改變,細(xì)胞的惡性程度下降。 4.BZAP45基因可能與黏液表皮樣癌的發(fā)生和/或發(fā)展有關(guān)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

[62]，成功構(gòu)建了自我滅活型載體系統(tǒng)( self-inactivationvectors，SIN)。這一系統(tǒng)保留了野生型病毒(圖1)基因的順式作用元件LTR，包裝信號(hào)(φ)，及Rev基因的反應(yīng)元件。去除了vif，vpr，vpu， nef等致病基因，保證了載體的生物安全性。將編碼病毒衣殼和包膜結(jié)構(gòu)的基因分別克隆于另外兩個(gè)質(zhì)粒中，通過(guò)三個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞產(chǎn)生完整的病毒顆粒。也就是說(shuō)

也就是說(shuō)，慢病毒載體系統(tǒng)主要由三種包含不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒構(gòu)成，分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(transfer vectors)，輔助質(zhì)粒(helper plasmids)，包膜表達(dá)質(zhì)粒(envelop expression plasmids)。結(jié)構(gòu)如圖2。其中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒除包含我們感興趣的外源基因外，同時(shí)還保留了病毒的LTR區(qū)和其他對(duì)病毒的整合復(fù)制起重要作用的元件。其中LTR區(qū)包含了慢病毒的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、包裝信號(hào)、整合位點(diǎn)(attachment site，Att)等結(jié)構(gòu)。包裝序列能夠使識(shí)別病毒RNA將其衣殼化并裝配到病毒顆粒中，Att位點(diǎn)使病毒基因可以整合入宿主基因。同時(shí)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中還加入了內(nèi)部啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄。輔助質(zhì)粒整合進(jìn)入包裝細(xì)胞后表達(dá)蛋白多聚體gag， 編碼病毒的衣殼蛋白及病毒的其他模序結(jié)構(gòu)(matrix structure)，同時(shí)表達(dá)蛋白pol， pol蛋白具有逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的活性

降解機(jī)制研究表明，RNAi引起的基因沉默是由dsRNA誘導(dǎo)的多程，長(zhǎng)度為2l-23nt的siRNA(small interfering RNoRNA)兩種類型的small RNA發(fā)揮了核心功能作用[92]。，對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控，靶mRNA并不發(fā)生變上的抑制效應(yīng)，植物中的某些miRNA會(huì)與特異mRNA相割，表明miRNA作用類似于siRNA[93]。最新的研究結(jié)果主要作用因子[94]。這里主要對(duì)siRNA介導(dǎo)的靶mRNA降以下幾個(gè)步驟：形成誘導(dǎo)細(xì)胞RNAi的關(guān)鍵組分，外源DNA、RNA序列均可RNA，但產(chǎn)生的方式不同。RNA病毒在病毒或細(xì)胞中R dependent RNA polymerases，RdRP)的催化下，合

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2830775