發(fā)布時(shí)間：2020-09-29 15:40

　　 人牙齦上皮細(xì)胞(human gingival epithelial cells,HGECs)長(zhǎng)期暴露于大量的細(xì)菌環(huán)境中,是防御病原微生物入侵牙周組織的第一道屏障。牙周炎是一種慢性感染性疾病,長(zhǎng)期的細(xì)菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)刺激可能會(huì)誘使HGECs對(duì)后續(xù)刺激的反應(yīng)性降低,即產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受的機(jī)制究竟是什么,是否與LPS的信號(hào)識(shí)別受體Toll樣受體 2(toll-like receptor 2,TLR2)和 Toll 樣受體 4(toll-like receptor 4,TLR4)有關(guān),它將如何影響牙周炎癥的發(fā)生和發(fā)展,目前尚不得而知。目的:本研究旨在建立一種HGECs的內(nèi)毒素耐受模型,并初步探討內(nèi)毒素耐受在牙周組織炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制,為進(jìn)一步闡明牙周炎發(fā)生發(fā)展的免疫學(xué)機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法:1.利用酶消化法體外分離培養(yǎng)HGECs;檢測(cè)角蛋白和波形絲蛋白的表達(dá),以確定其生物學(xué)來源;并采用MTT法觀察HGECs在體外的生長(zhǎng)特性。2.采用 1μg/ml 牙拃卟啉單胞菌(Pophyromonasg gingivalis,P.gingivalis)LPS和/或1μg/ml大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)LPS重復(fù)刺激或交叉重復(fù)刺激,建立HGECs的內(nèi)毒素耐受模型。利用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6,和趨化因子IL-8表達(dá)水平的變化。3.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)TLR2,4 mRNA在HGECs的表達(dá);采用real-time PCR技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HGECs產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受或交叉耐受后,TLR2,4 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.通過酶消化法分離培養(yǎng)的HGECs表達(dá)角蛋白,屬于外胚層來源的細(xì)胞,在體外具有良好的增殖能力。2.1 μg/ml P.gingivalis LPS 或 1μg/ml E.coli LPS 刺激 HGECs 24h 后,細(xì)胞條件培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到IL-1β、IL-6和IL-8,三種細(xì)胞因子的分泌水平均較刺激前明顯增高(p0.05)。上述兩種LPS重復(fù)刺激或交叉重復(fù)刺激后,IL-6和IL-8的表達(dá)水平均較單次刺激后明顯降低(p0.05);1μg/ml E.coli LPS重復(fù)刺激后,IL-1β的分泌水平也較單次刺激后明顯降低(p0.05)。表明,內(nèi)毒素耐受模型的構(gòu)建是成功的。3.來自不同個(gè)體的HGECs 均表達(dá)TLR2,4mRNA。1μg/ml P.gingivalis LPS刺激HGECs后,TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(p0.05);1μg/ml E.coli LPS刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)(p0.05)。1μg/ml P.gingivalisLPS重復(fù)刺激后,TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較單次刺激后明顯降低(p0.05);1μg/ml E.coli LPS重復(fù)刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平也較單次刺激后明顯降低(p0.05)。結(jié)論:本研究首次構(gòu)建了 HGECs的內(nèi)毒素耐受模型,并初步探討了內(nèi)毒素耐受對(duì)牙周組織炎癥和免疫反應(yīng)的影響,及其作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示,P.gingivalis LPS和(或)E.coli LPS重復(fù)刺激能誘導(dǎo)HGECs產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受,不同程度的抑制細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌,這種耐受可能與TLR2,4表達(dá)水平的降低有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

圖３體外培養(yǎng)的第二代ＨＧＥＣｓ邋（１００ＥＣｓ的來源鑒定逡逑絲和角蛋白分別是中胚層和外胚層來源細(xì)ＨＧＥＣｓ抗人角蛋白單克隆抗體染色陽(yáng)性（圖體染色陰性（圖５），證實(shí)其為外胚層來

可見細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈斑塊狀分布。生長(zhǎng)良好的ＨＧＥＣｓ呈典型的“鋪逡逑路石狀”，細(xì)胞扁平，細(xì)胞核大而清晰，位于中央，呈圓形或卵圓形，有逡逑數(shù)個(gè)核仁（圖１－３）。逡逑１７逡逑

圖１原代培養(yǎng)３天的ＨＧＥＣｓ邋（４０Ｘ）邋圖２體外培養(yǎng)的第二代ＨＧＥＣｓ邋（邋４０Ｘ）＿逡逑圖３體外培養(yǎng)的第二代ＨＧＥＣｓ邋（１００Ｘ）逡逑１．２．２邋ＨＧＥＣｓ的來源鑒定逡逑波形絲和角蛋白分別是中胚層和外胚層來源細(xì)胞的特異性標(biāo)志。本逡逑實(shí)驗(yàn)所獲得的ＨＧＥＣｓ抗人角蛋白單克隆抗體染色陽(yáng)性（圖４），抗人波形逡逑

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