目的：舌癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)約占全部口腔癌的40%。舌癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高,臨床預(yù)后較差。盡管近幾十年來(lái)其治療方法不斷得以改進(jìn)和完善,但患者的五年生存率并未得到顯著提高。腫瘤的局部復(fù)發(fā)和區(qū)域性淋巴轉(zhuǎn)移是舌癌患者治療失敗的主要原因,而腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中的重要因素,因此有關(guān)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲機(jī)制的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)為半乳糖結(jié)合蛋白家族成員,具有多種生物學(xué)功能,在許多腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)GaI-3舌癌組織中過(guò)表達(dá),但其在舌癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和確切機(jī)制尚不十分清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),Gal-3在某些腫瘤組織中的表達(dá)與β-catenin有關(guān)。由于β-catenin是經(jīng)典Wnnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子,因此我們猜測(cè)Gal-3可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本課題采用免疫組織化學(xué)染色對(duì)76例舌癌組織標(biāo)本中Gal-3的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)合臨床資料研究Gal-3表達(dá)與舌癌相關(guān)臨床病理因素的關(guān)系：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默人舌癌細(xì)胞系SCC-4和CAL27中Gal-3基因,研究其在舌癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用；通過(guò)檢測(cè)Gal-3基因沉默前后Wnt/β-catenin(?)言號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子表達(dá)水平的改變,探討Gal-3在舌癌細(xì)胞中表達(dá)與Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系,旨在為進(jìn)一步闡明舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 方法：1.采用免疫組織化學(xué)SP法,對(duì)2005～2010年于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔頜面外科就診的76例舌癌患者腫瘤組織標(biāo)本中Gal-3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),并結(jié)合臨床資料分析Gal-3表達(dá)與腫瘤分化、臨床分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素間的關(guān)系。 2.將液氮保存的舌癌細(xì)胞SCC-4和CAL27于37℃水浴中快速溶化,用預(yù)冷的培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液,在4℃下1800rpm離心10min。棄上清,重懸細(xì)胞于新鮮培養(yǎng)液中,SCC-4采用RPMI640,CAL27采用高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 3.采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,按照Invitrogen公司LpofectamineTM RNAiMAX試劑說(shuō)明書操作,分別將control-siRNA和Gal-3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理。37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)6h后,替換為含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后481h,對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為以及相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 4.轉(zhuǎn)染后48h收集各組細(xì)胞,采用Trizol(?)去提取總RNA。采用TIANGEN公司Quantscript RT K it試劑盒,取模板RNA1μg,加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,合成cDNA第一鏈。應(yīng)用TIANGEN公司RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒,以1μl cDNA為模板,在7500Real Time PCR System中進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)用Sequence Detection Software version1.4對(duì)Gal-3的表達(dá)進(jìn)行分析。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。引物序列為：Gal-3上游引物5'-GGCCACTGA-TTGTGCCTTAT-3',下游引物5'-TGCAACCTTGAAGTGGTCAG-3';β-actin上游引物5'-CTCCTC-CTGAGCGC AAGTACTC-3',下游引物5-TCCTGCTTGCTGATCCACATC-3'。 5.轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞,用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50μg蛋白上樣,12%SDS-PAGE膠垂直電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜,加入1：1000兔抗人Gal-3多克隆抗體,4℃反應(yīng)過(guò)夜,TBST洗膜,加入1：2000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,室溫孵育2h,ALP顯色。掃描、分析Gal-3蛋白的表達(dá)。以β-actin (?)乍為內(nèi)參照。 6.采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞接種于96孔板,每孔細(xì)胞數(shù)約為2.0×103。37℃,5%CO2條件下過(guò)夜,細(xì)胞達(dá)到鋪滿30～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h和72h在每孔加入CCK-810μl,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度(OD值),記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸,OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 7.將適當(dāng)密度轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,形成細(xì)胞單層。用移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部形成“一”字劃痕。鏡下記錄劃痕相對(duì)距離,更換體積分?jǐn)?shù)為1%胎牛血清的RPMI1640/H-DMEM培養(yǎng)基,24h后更換體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640/H-DM EM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,鏡下觀察各組腫瘤細(xì)胞遷移能力的差異。 8.應(yīng)用Yranswell小室法觀察Gal-3基因沉默對(duì)SCC-4和CAL27細(xì)胞侵襲能力的影響。RNA干擾后48h,收集各組細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。將細(xì)胞懸液加入Transwell小室中,每孔100μl,將小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2孵箱內(nèi)孵育8h。取出Transwell小室,濾膜用甲醇固定1分鐘。HE染色,顯微鏡下觀察、照相并計(jì)數(shù)。 9.轉(zhuǎn)染后48h,收集各組細(xì)胞,采用WB法對(duì)對(duì)腫瘤細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；采用RealTime RT-PCR法對(duì)其mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。β-catenin引物序列為：上游引物5'-GCCGGCTATTGTAGAAGCTG-3',下游引物5'-GAG-TCCCAAGGAGACCTTCC-3'。采用免疫熒光法染色,并應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后β-catenin在SCC-4亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中定位的變化情況。 10.轉(zhuǎn)染后48h,采用相同方法檢測(cè)各組細(xì)胞中Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表達(dá)。并于轉(zhuǎn)染后0h、12h、24h和48h,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組SCC-4細(xì)胞中Gal-3、β-catenin、pAkt和pGSK-3β蛋白的表達(dá)。 11.為進(jìn)一步明確Akt磷酸化在Gal-3/β-catenin軸中的作用,分別采用Akt抑制劑和(或)Gal-3-siRNA對(duì)SCC-4進(jìn)行處理。Gal-3-siRNA轉(zhuǎn)染后48h,采用WB法檢測(cè)各組細(xì)胞中Akt、pAkt和β-catenin蛋白的表達(dá)。 12.為證實(shí)Gal-3沉默系通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因的表達(dá)影響舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲,于轉(zhuǎn)染后48h,分別采用RT-PCR法和WB法檢測(cè)SCC-4中MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.76例患者腫瘤組織標(biāo)本中Gal-3表達(dá)的陽(yáng)性率為86.8%。著色主要位于腫瘤上皮細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)中纖維細(xì)胞的胞漿,胞核染色為陰性。Gal-3表達(dá)的強(qiáng)度與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期有關(guān),與患者年齡、性別、腫瘤大小及組織分化程度等因素?zé)o顯著相關(guān)性。 2.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染后48h,Gal-3-siRNA處理組Gal-3mRNA及蛋白的表達(dá)明顯受到抑制。Gal-3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)SCC-4和CAL27細(xì)胞Gal-3mRNA表達(dá)的抑制率分別為99.4%和98.6%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Gal-3蛋白的表達(dá)亦顯著降低。在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為方面,實(shí)驗(yàn)顯示,在轉(zhuǎn)染后72h內(nèi),Gal-3-siRNA處理組腫瘤細(xì)胞在增殖能力方面較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)顯著下降。而細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,Gal-3沉默可顯著降低兩種細(xì)胞的遷移能力。Gal-3-siRNA處理組細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間較陰性對(duì)照組組和空白對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。此外,實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell小室法證實(shí),抑制Gal-3基因的表達(dá)可顯著降低舌癌細(xì)胞的侵襲能力。 3.本研究對(duì)Gal-3-siRNA作用后舌癌細(xì)胞中β-catenin(?)勺表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Gal-3沉默可顯著影響腫瘤細(xì)胞中β-catenin蛋白的水平。為明確Gal-3對(duì)β-catenin表達(dá)的調(diào)控是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄階段,我們對(duì)β-catenin mRNA的水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然Gal-3沉默導(dǎo)致β-catenin蛋白下調(diào),但其mRNA的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著改變。提示Gal-3沉默對(duì)β-catenin表達(dá)的影響發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后階段。通過(guò)免疫熒光法染色,觀察轉(zhuǎn)染前后β-catenin在SCC-4亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中定位發(fā)現(xiàn),在SCC-4中Gal-3-siRNA轉(zhuǎn)染后48h,β-catenin在胞漿與胞核中的表達(dá)均顯著降低。 4.為明確Gal-3在β-catenin表達(dá)調(diào)控中的作用機(jī)制,我們對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子Akt和GSK-3β的總蛋白和磷酸化蛋白的水平進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),在各組細(xì)胞中Gal-3沉默并未導(dǎo)致Akt和GSK-3p總蛋白水平發(fā)生明顯變化,然而在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中兩種蛋白的磷酸化形式顯著降低。相反,對(duì)照組中pAkt和pGSK-3β的水平無(wú)明顯變化。本研究還對(duì)實(shí)驗(yàn)組SCC-4細(xì)胞中Gal-3、pAkt、pGSK-3β以及β-catenin蛋白水平的時(shí)相變化進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Gal-3、pAkt、pGSK-3β及β-catenin的水平均較轉(zhuǎn)染前顯著降低。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)pAkt和pGSK-3β(?)水平的降低發(fā)生于轉(zhuǎn)染后12小時(shí),早于β-catenin蛋白下調(diào)發(fā)生的時(shí)間。此外,本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Akt抑制劑抑制Akt磷酸化與應(yīng)用Gal-3-siRNA沉默Gal-3基因的表達(dá)均可導(dǎo)致SCC-4中β-catenin蛋白表達(dá)顯著下降。應(yīng)用Akt抑制劑后,再加入Gal-3-siRNA不會(huì)引起β-catenin蛋白水平進(jìn)一步降低。 5.應(yīng)用RT-PCR(?)去和WB法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后48h舌癌細(xì)胞SCC-4中MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。 結(jié)論：1.Gal-3過(guò)表達(dá)與舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 2.沉默Gal-3可顯著抑制舌癌細(xì)胞SCC-4與CAL27的遷移和侵襲能力。 3.抑制Gal-3基因表達(dá),可導(dǎo)致舌癌細(xì)胞中β-catenin蛋白水平下調(diào),但不影響其轉(zhuǎn)錄；Gal-3基因沉默使β-catenin蛋白在胞漿與胞核中的水平均顯著降低。 4.Gal-3表達(dá)可能通過(guò)活化Akt,調(diào)控GSK-3β磷酸化水平及胞漿p-Catenin的快速降解過(guò)程,從而作用于Wnt信號(hào)通路下游靶基因,最終影響舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R739.8

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2824577