細胞致死性擴張毒素(cytolethal distending toxin,CDT)是一種新發(fā)現(xiàn)的由某些G-致病菌分泌的特殊的細菌毒素,能夠引起上皮細胞、成纖維細胞和淋巴細胞細胞周期G2/M期阻滯。伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa )是局限型侵襲性牙周炎的主要可疑致病菌,也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能表達CDT的口腔細菌。CDT由CdtA、CdtB和CdtC組成,CdtB已被證明是毒性亞基,但CdtA和CdtC的功能尚不明確。 [目的]通過細胞毒性實驗篩選毒性缺陷、缺失的突變位點,明確維持CdtA活性正常發(fā)揮的關(guān)鍵氨基酸基團,探討Aa CdtA結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。 [方法]以Aa ATCC 29522基因組DNA為模板,采用PCR法獲得野生型cdtA、cdtB、cdtC基因,經(jīng)雙酶切、連接的定向克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達載體。以構(gòu)建好的野生型pET-15b-cdtA質(zhì)粒DNA為模板,采用定點突變技術(shù)獲得突變型pET-15b-cdtAY105A、pET-15b-cdtAY181A、pET-15b-cdtAY125A。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western blot檢測并鑒定蛋白表達。Ni-HisTrap HP預(yù)裝柱對各重組蛋白進行體外純化,純化重組的CdtB體外與超螺旋質(zhì)粒(pET-32a)DNA孵育,觀察其生物學(xué)活性,判定各重組蛋白是否具有生物學(xué)活性。野生型和突變型CdtA分別與野生型CdtB、CdtC等量混合于重構(gòu)緩沖溶液,分別與Hela細胞和CHO共孵育,MTT檢測Hela細胞增殖抑制效應(yīng)、克隆形成數(shù)目cfu(colony-forming units)計算活細胞數(shù);倒置相差顯微鏡觀察Hela細胞致死性擴張的形態(tài)學(xué)改變;流式細胞儀分析Hela細胞周期阻滯情況。 [結(jié)果]經(jīng)測序鑒定,構(gòu)建的野生型原核表達載體pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC轉(zhuǎn)染的感受態(tài)大腸桿菌均各自攜帶有cdtA、cdtB、cdtC基因,且基因片段與GenBank中已收錄的Aa cdtA、cdtB、cdtC基因序列一致性高達99%。構(gòu)建的突變型原核表達載體pET-15b-cdtAY105A、pET-15b-cdtAY181A、pET-15b-cdtAY125A突變位點完全正確。Western blot觀察到帶有His6-tag標記的目的蛋白CdtA、CdtB、CdtC、CdtAY105A、CdtAY181A、CdtAY125A。單獨的野生型CdtA、CdtB和三個突變型CdtAY105A、CdtAY181A、CdtAY125A蛋白對細胞生長均無抑制作用。單獨的CdtC蛋白和野生型CDT全毒素具有細胞致死性擴張的生物學(xué)活性。與野生型CDT全毒素相比,突變型全毒素CdtAY105ABC的生物學(xué)活性明顯降低,突變型全毒素CdtAY181ABC的生物學(xué)活性略有增強,突變型全毒素CdtAY125ABC的生物學(xué)活性相比沒有明顯變化。 [結(jié)論]本研究成功獲得了體外重組的野生型CDT和突變型CDT全毒素,初步篩選獲得Aa CdtA的兩個潛在功能位點CdtAY105A、CdtAY181A,為進一步研究CdtA的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R781.4
【部分圖文】：

南京證實CdtB 具有DNase I 樣功能。故可活性來推定各重組蛋白體外復(fù)性成功性后CdtB 與超螺旋質(zhì)粒pET-32a DNA7.0）,10mM Mgcl2,5mM Cacl2）37℃孵脫氧核糖核酸酶樣生物學(xué)活性,未經(jīng)處16s rRNA PCR 鑒定的電泳結(jié)果糖凝膠電泳，可見大小為557bp 的特異實該細菌為 Aa(圖1-1) 。

圖1-2 PCR 擴增目的基因片段的1%瓊脂糖凝膠電泳1 DL 2000Marker；2-4 分別為cdtA、cdtB、cdtC 基因大小約為669bp、852bp、561bp）電泳及測序結(jié)果9-T 中間載體的各基因片段PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖p、716bp 大小的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖

（4） 重組質(zhì)粒電泳及測序結(jié)果連接上pMD19-T 中間載體的各基因片段PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別可見824bp、1007bp、716bp 大小的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1-3）。圖1-3 重組原核表達載體pMD19-T-cdtA、pMD19-T-cdtB、pMD19-T-cdtC 1%電泳圖片(1 DL2000Marker 2 分別為pMD19-T-cdtA、pMD19-T-cdtB、pMD19-T-cdtC（從左至右）連接上 pET-15b 原核表達載體的各基因片段PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分別可見935bp、1118bp、827bp 大小的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖 1-4）。圖1-4 重組原核表達載體pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC 1%電泳圖片(1 DL2000Marker 2 分別為pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC（從左至右）)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馮向輝;張立;孟煥新;徐莉;陳智濱;釋棟;;侵襲性牙周炎病原微生物的檢測[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年06期

本文編號：2824315