目的1.對比原代細(xì)胞BMSCs、ADSCs細(xì)胞增殖能力,成骨、成脂分化能力,選擇合適的干細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的研究細(xì)胞。2.觀察在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下,脂肪干細(xì)胞內(nèi)miR503、miR144的表達(dá)情況。3.檢測Mimic-miR503、Inhibitor-miR144促進(jìn)ADSCs成骨分化,Mimic-miR503、與Inhibitor-miR144聯(lián)合轉(zhuǎn)染對ADSCs成骨分化具有協(xié)同作用。方法提取SD大鼠原代BMSCs和ADSCs,通過顯微鏡下比較細(xì)胞的形態(tài);細(xì)胞流式檢測細(xì)胞表型;P3代細(xì)胞計(jì)數(shù),檢測細(xì)胞的增殖能力并繪制生長曲線;成骨誘導(dǎo)進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色、成脂誘導(dǎo)行油紅O染色;qRT-PCR檢測成骨、成脂相關(guān)基因比較兩組細(xì)胞的成骨成脂分化能力。P3代ADSCs成骨誘導(dǎo)組和空白對照組,利用qRT-PCR檢測miR503和miR144相對表達(dá)量。miRNA數(shù)據(jù)庫Target Scan(http://www.target scan.org)預(yù)測miRNA503-5p和miRNA144-5p相關(guān)作用靶點(diǎn),miRNA503-5p靶向成骨基因主要包括:WNT3ɑ、ATK3、SMAAD7、WNT4,miRNA144-5p靶向成骨基因主要包括:TFG、SMAD6、SMAD5、SMAD1、WNT2、WNT5α、WNT7α、BMP10、MMP13等。體外轉(zhuǎn)染Mimic-miR503(M組)、Inhibitor-miR144(I組)、Mimic-miR503和Inhibitor-miR144混合物(M+I組)、實(shí)驗(yàn)對照組(NC組),實(shí)現(xiàn)miR503的過表達(dá)和miR144低表達(dá);細(xì)胞流式檢測ADSCs的細(xì)胞表型;MTT檢測四組ADSCs的增殖能力并繪制相關(guān)生長曲線;ALP染色、qRT-PCR、Western Blot檢測各組的成骨標(biāo)志物。結(jié)果BMSCs、ADSCs均可穩(wěn)定傳代至P10代,細(xì)胞形態(tài)均一,穩(wěn)定;均具有成骨、成脂分化能力;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示P3代ADSCs的增殖能力強(qiáng)于BMSCs(P0.05)。QRT-PCR顯示:ADSCs成骨誘導(dǎo)組與空白對照組相比,miR503表達(dá)量升高50倍,miR144表達(dá)量降低2倍。M組、I組、M+I組分別相對于NC組,ALP染色強(qiáng)度較強(qiáng)(116.623±3.02%,117.9753±2.97%,141.2263±3.59%)。與M組、I組相比,M+I組ALP染色強(qiáng)度較強(qiáng)(25.7230±2.73%,24.5267±2.53%)。qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因,M組、I組、和M+I組細(xì)胞中的所有成骨相關(guān)基因(RUNX2、BSP、OCN)的表達(dá)水平均明顯高于NC組的表達(dá)水平,M+I組細(xì)胞中的成骨相關(guān)基因(RUNX2、BSP)的表達(dá)水平則明顯高于M組和I組的表達(dá)水平,且M組與I組之間沒有明顯差異。結(jié)論相對于BMSCs,ADSCs具有來源廣泛,增殖能力強(qiáng),具有骨向分化能力,ADSCs可為本實(shí)驗(yàn)成骨分化的研究細(xì)胞。miR503、miR144可能參與調(diào)控ADSCs成骨分化。M+I組成骨能力強(qiáng)于M組、I組,轉(zhuǎn)染組成骨能力都強(qiáng)于陰性對照NC組。Mimic-miR503活化經(jīng)典Wnt/β-catenin通路、Inhibitor-miR144活化SMAD信號(hào)通路促進(jìn)ADSCs骨向分化,Mimic-miR503和Inhibitor-miR144協(xié)同促進(jìn)骨向分化。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

圖1：P3和P10 BMSCs和ADSCs兩組細(xì)胞的形態(tài)特征。A.分離培養(yǎng)得到的大鼠BMSCs（P3）;B.分離培養(yǎng)得到的大鼠ADSCs(C.傳代培養(yǎng)大鼠BMSCs（P10）;D.傳代培養(yǎng)大鼠ADSCs（P10)二、BMSCs和ADSCs生長曲線該生長曲線可簡單的分為：細(xì)胞經(jīng)過數(shù)分鐘的懸浮期隨后貼壁，經(jīng)同的潛伏期；隨后進(jìn)入細(xì)胞對數(shù)增長期；細(xì)胞密度達(dá)到飽和時(shí)，即達(dá)到然后退化消亡期。圖2結(jié)果可看出BMSCs前2d生長速度稍快于ADSCs，但的生長速度明顯快于BMSCs，兩組細(xì)胞在第6d時(shí)到穩(wěn)定期，BMSCs總數(shù)僅的6倍，而ADSCs總數(shù)為起始時(shí)的10倍。

17圖2：P3代 BMSCs和ADSCs增殖曲線呈典型的“S”形（P＜0.01，**表示）三、 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果流式結(jié)果圖 3 顯示：P3BMSCsCD34（造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志）和 CD45（白細(xì)胞表面抗原）表達(dá)率較低分別為 1.73%和 0.58%，CD29 和 CD90(間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志蛋白)表達(dá)率在 95%以上，強(qiáng)陽性。P3ADSCs 也表現(xiàn)出相似的 CD34、CD45 低表達(dá)和 CD29、CD90 的 強(qiáng)陽性表達(dá)。圖 3：p3 BMSCs 和 ADSCs 表面抗原標(biāo)記物的表達(dá)四、堿性磷酸酶染色結(jié)果兩組細(xì)胞誘導(dǎo)組和空白對照組進(jìn)行ALP染色（見圖4），以胞漿內(nèi)含有藍(lán)色顆粒為陽性反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組藍(lán)色沉淀明顯多于空白對照組，說明兩組細(xì)胞均有骨向分化能力，BMSCs骨向分化能力強(qiáng)于ADSCs。

圖2：P3代 BMSCs和ADSCs增殖曲線呈典型的“S”形（P＜0.01，**表示）三、 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果流式結(jié)果圖 3 顯示：P3BMSCsCD34（造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志）和 CD45（白細(xì)胞表面抗原）表達(dá)率較低分別為 1.73%和 0.58%，CD29 和 CD90(間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志蛋白)表達(dá)率在 95%以上，強(qiáng)陽性。P3ADSCs 也表現(xiàn)出相似的 CD34、CD45 低表達(dá)和 CD29、CD90 的 強(qiáng)陽性表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 肖仕輝;韋慶軍;趙勁民;薄占東;韋積華;李偉岸;;全骨髓貼壁法培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向成骨誘導(dǎo)分化及鑒定[J];中國組織工程研究;2013年06期

2 鄭亮;李萍華;劉鈺瑜;崔燎;;誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究;2012年32期

3 王亦菁,金巖,史俊南,劉源,軒東英;牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2005年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李麗莉;BMP-Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其在成骨分化中的作用[D];山東大學(xué);2013年

2 張文文;BMP9需通過調(diào)控Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及其作用機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2824313