發(fā)布時間：2020-09-19 21:21

　　 宏蛋白質(zhì)組學是對特定時間點環(huán)境微生物整體蛋白質(zhì)組成成份的大規(guī)模特征性描述。與宏基因組學相比,宏蛋白質(zhì)組學可以系統(tǒng)地描繪微生物功能的動態(tài)變化�？谇皇侨祟愇⑸锝M計劃重點關(guān)注的五大人體部位(腸道、口腔、皮膚、鼻腔和泌尿生殖道)之一�？谇晃⑸鷳B(tài)的失衡不僅可誘發(fā)多種口腔疾病,還與腫瘤、糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、早產(chǎn)等全身疾病緊密相關(guān),對人類健康影響重大。因此,利用宏蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究口腔微生物的組成和功能對于疾病的診療具有重要意義。目前口腔宏蛋白質(zhì)組學研究已取得了一定的研究成果,但在數(shù)據(jù)分析方面仍有待完善。人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫(Human Oral Microbiome Database,HOMD)是口腔宏蛋白質(zhì)組研究中常用的數(shù)據(jù)庫。但大量已被口腔宏基因組研究發(fā)現(xiàn)的微生物菌屬未被收錄其中。不完整的數(shù)據(jù)庫可能會導致錯誤的宏蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。另一方面,缺乏易于使用的宏蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析的工作流。因此,為獲得更完整、準確的口腔宏蛋白質(zhì)組研究結(jié)果,需首先構(gòu)建口腔宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,并對其數(shù)據(jù)分析方法和工作流進行優(yōu)化,建立新的口腔宏蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析工作流。牙周炎是常見的口腔疾病之一,能引起牙齒周圍組織的炎癥,嚴重時可導致牙齦從牙齒上脫落或牙齒松動、直接脫落。齦溝液是口腔體液之一,作為血清滲出物或炎性滲出物,可以反映宿主對微生物斑塊攻擊的響應幅度。因此齦溝液蛋白質(zhì)組成的測定可為牙周和全身疾病的診斷提供信息。已有研究利用宏蛋白質(zhì)組學方法,在唾液和牙菌斑中鑒定牙周炎導致的菌群變化,但目前尚無牙周炎齦溝液宏蛋白質(zhì)組學的研究。本研究的主要內(nèi)容分為兩部分。第一部分,口腔宏蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析工作流的建立,主要包括以下幾點研究內(nèi)容:(1)構(gòu)建口腔宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫HOMPPD(Human Oral MetaProteome Plus Database);(2)建立基于HOMPPD的數(shù)據(jù)分析工作流;(3)利用建立的工作流對唾液蛋白質(zhì)組的公共數(shù)據(jù)進行宏蛋白質(zhì)組學重分析。第二部分,牙周炎齦溝液宏蛋白質(zhì)組學研究,主要包括以下幾點研究內(nèi)容:(1)牙周炎患者和正常人群的人類和微生物蛋白質(zhì)組構(gòu)成比較分析;(2)牙周炎患者與正常人群差異蛋白質(zhì)鑒定;(3)牙周炎患者的微生物菌群構(gòu)成變化研究。本研究得到了如下主要研究結(jié)果:1.通過整合HOMD和兩篇已發(fā)表的宏基因組研究結(jié)果構(gòu)建了一個人類口腔宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫HOMPPD(Human Oral MetaProteome Plus Database),HOMPPD包括184個菌屬、2793個菌種的蛋白序列,并免費提供數(shù)據(jù)庫下載,下載地址為:ftp://111.198.139.72:4000//pub//metaproteomics//homppd.fasta。2.建立一個基于HOMPPD的口腔宏蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析工作流,主要包括如下數(shù)據(jù)分析模塊:利用“兩步法”策略檢索HOMPPD數(shù)據(jù)庫、微生物類群鑒定和下游生物信息學分析。3.利用公共唾液蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)集,對HOMPPD進行了初步測試,結(jié)果表明,利用HOMPPD能比HOMD多鑒定出23.98%的新菌肽、39個HOMD中未收錄的新菌屬和124個新菌種,證明了使用HOMPPD進行檢索可以更加全面地鑒定唾液微生物的菌群組成。4.利用構(gòu)建的HOMPPD及其工作流對唾液宏蛋白質(zhì)組進行了重分析,發(fā)現(xiàn)唾液微生物的菌屬主要分布在FCB group和4個門中(Proteobacteria、Fusobacteria、Firmicutes、Actinobacteria),且不同健康個體的唾液微生物組的菌屬構(gòu)成存在著較大的個體差異,同時也說明上述建立的工作流具有良好的實用性。5.應用上述工作流對牙周炎齦溝液蛋白質(zhì)組進行了分析,結(jié)果顯示牙周炎組與正常組齦溝液中的細菌蛋白質(zhì)均占所有蛋白質(zhì)總鑒定數(shù)的1/3;同時發(fā)現(xiàn)了166個差異表達的人蛋白,其中50個在牙周炎組高表達,主要與免疫功能以及炎癥的發(fā)生相關(guān);67個差異表達的細菌蛋白,其中31個在牙周炎組高表達,主要與氨基酸、碳水化合物以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與新陳代謝相關(guān)。6.初步明確了牙周炎患者微生物菌屬的構(gòu)成,牙周炎患者的微生物菌屬總豐度降低,但構(gòu)成更加多樣化;5個菌屬在牙周炎組被特異性鑒定;構(gòu)建了牙周炎組與正常組所有鑒定菌屬的進化關(guān)系樹,結(jié)果表明牙周炎組與正常組鑒定的菌屬均主要分布在Fusobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes這四個門和FCB group中,而5個牙周炎組特異性鑒定的菌屬都屬于Firmicutes。對兩組共同鑒定菌屬的主成分分析(PCA)結(jié)果顯示,牙周炎組與正常組鑒定的菌屬豐度分布具有顯著差異。以上結(jié)果表明牙周炎患者的微生物組在定性和定量水平均發(fā)生了明顯的變化。通過差異分析發(fā)現(xiàn)10個菌屬在牙周炎組特異高表達。牙周炎和正常組的最優(yōu)勢菌屬不同,分別為Treponema和Neisseria。綜上所述,本研究構(gòu)建了一個基于HOMPPD的完整的宏蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析的工作流,可以完成從多肽鑒定到微生物類群構(gòu)成和進化關(guān)系的數(shù)據(jù)分析。其中,HOMPPD數(shù)據(jù)庫更全面地收集了口腔微生物的蛋白質(zhì)序列信息,使用該數(shù)據(jù)庫進行檢索可以更全面的鑒定口腔微生物的構(gòu)成。應用該工作流,本研究對牙周炎齦溝液蛋白質(zhì)組進行了分析,發(fā)現(xiàn)了牙周炎患者齦溝液中人類和微生物蛋白質(zhì)、以及微生物菌屬構(gòu)成的變化,為牙周炎的致病機制和生物標志物研究提供了重要信息。
【學位單位】：河北大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

圖 1-1 宏蛋白質(zhì)組學樣本制備與數(shù)據(jù)分析流程（Xu Zhang.et al 2017）目前宏蛋白質(zhì)組學技術(shù)已應用于土壤、海洋、人體部位等微環(huán)境中微生物組成及其功能的研究。在人體上的應用主要集中在口腔、皮膚、胃、陰道和腸道這五大部位，其中腸道宏蛋白質(zhì)組學研究最為深入[4-8],口腔宏蛋白質(zhì)組研究也有大量報道[9-11]。2015 年Belda-Ferre P 等[9]首次提出了利用宏蛋白質(zhì)組技術(shù)研究口腔生物膜的蛋白質(zhì)組與微生物組的變化，提供了人類牙菌斑的第一個可用蛋白質(zhì)庫，同時檢測到了七種細菌和五種人類蛋白質(zhì)功能，可以確定所研究個體的健康狀況，其預測的特異性和靈敏度超過了 96％2016 年，Belstr m Daniel 等[10]利用宏蛋白質(zhì)組學方法研究了牙周炎患者、齲齒患者與健康人群之間唾液微環(huán)境中蛋白質(zhì)以及微生物組成的變化，發(fā)現(xiàn)在口腔疾病狀態(tài)下高表達的蛋白質(zhì)主要參與補體系統(tǒng)和炎癥發(fā)生相關(guān)的過程。健康和患病個體中的類似細菌蛋白質(zhì)組表明唾液微生物群主要在浮游狀態(tài)下生長，表達沒有代謝活動的疾病相關(guān)特征。在2018 年，Olsen 團隊發(fā)表了一篇關(guān)于中世紀化石牙齒定量宏蛋白質(zhì)組學的研究，結(jié)果提示定量宏蛋白質(zhì)組學有可能從考古學背景中提供關(guān)于個體口腔健康狀況額外的分子信

也稱為牙齦疾病，是一種影響牙齒周圍組織的炎癥[52]。在早期，組織），牙齦腫脹，紅色，并可能出血。更嚴重的形式稱為牙周炎（周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)），牙齦會從牙齒上脫落，骨頭可能會丟失，脫落[52]，也可能出現(xiàn)口臭[53]。牙周病作為常見的口腔疾病，是引起主要原因之一，也是危害人類牙齒和全身健康的主要口腔疾病[54]。其現(xiàn)為牙齦發(fā)紅（炎癥表現(xiàn)）或出血、形成牙周袋、牙齒咀嚼無力并出，嚴重者牙齒可自行脫落或者拔除牙齒。如圖 1-2 所示，健康的牙周組根的結(jié)締組織和牙槽骨。此外，口腔上皮覆蓋這種支持組織，并且有其連接到牙齒表面。上皮表面和牙齒之間的空間稱為溝，里面充滿了右）的情況下，牙菌斑生物膜積聚在牙齒和牙根表面并導致牙周結(jié)締壞，導致世界上最常見的牙齒脫落。且牙周病患者的牙齒會出現(xiàn)菌斑生炎癥等現(xiàn)象。

河北大學碩士學位論文錄物種及以上水平的微生物類群，篩選去掉有 ATCC/phage/virus/subs有蛋白序列；2）每一個物種至少包含 5 個或以上的蛋白質(zhì)序列[37]；行去冗余，僅保留了同微生物類群中同一蛋白/多肽最長的序列；4）或別名所對應的菌屬未在 104 個菌屬的列表中，則去掉這些微生物類。最終我們得到了 95 個菌屬蛋白序列數(shù)據(jù)庫庫，命名為 95GP（95。該過程通過自行編碼的 Python 程序?qū)崿F(xiàn)。OMPPD 的構(gòu)建下載的 HOMD 蛋白質(zhì)組序列和 95GP，構(gòu)建 HOMPPD。在合并過程中存在于 HOMD 中，則以 95GP 蛋白序列取代 HOMD 內(nèi)的序列。

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