非血管化游離骨移植(NVBG)的出現(xiàn)為眾多頜骨缺損的患者帶來了福音,直至目前這一技術(shù)仍是最常用的頜骨修復手段之一。對于NVBG的愈合過程,傳統(tǒng)的“爬行替代”理論認為移植骨終將吸收,被新生骨組織所逐漸替代。在這一理論的指導下,NVBG同期種植過去一直被視為禁忌。本實驗在課題組前期研究的基礎(chǔ)上分別用犬和轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建NVBG植骨模型,以移植骨轉(zhuǎn)歸、新骨生成、血供重建、種植體骨結(jié)合為研究重點,試圖全面反映移植骨愈合全貌;探討新生骨的來源和促進種植體骨結(jié)合的因素,為NVBG及同期種植的臨床應用提供理論和實驗基礎(chǔ)。 本實驗分為3個部分。 第一部分構(gòu)建犬下頜骨缺損游離髂骨移植的動物模型,并以此為基礎(chǔ),對移植骨的細胞活力、成骨方式、血供重建、VEGF和TGF-β1表達作一深入研究,探討NVBG移植骨的愈合規(guī)律和促進因素。 實驗方法:選用實驗犬12只(術(shù)前1個月拔除雙側(cè)下頜前磨牙),選取一側(cè)下頜骨造成2.5cm全層骨缺損,植入同樣大小的全層自體髂骨,重建鈦板固定。髂骨塊離體時間控制在20min以內(nèi)。術(shù)后1、2、4個月取材,行大體、X線、下齒槽動脈造影、組織學、墨汁灌注微血管計數(shù)、骨組織形態(tài)計量學、TGF-β1原位雜交、VEGF和TGF-β1免疫組織化學觀察。 實驗結(jié)果: X線觀察表明移植骨區(qū)呈現(xiàn)漸進性的骨修復和改建的過程。術(shù)后1個月:移植骨塊密度不均,近牙槽嵴頂處有少量吸收,交界區(qū)呈不規(guī)則透光影。術(shù)后2個月:移植骨較1個月前密度有所增加,但仍低于周邊頜骨;交界區(qū)仍有部分透光影。術(shù)后4個月:植骨區(qū)形態(tài)不規(guī)則,密度明顯高于周圍頜骨;移植骨與宿主骨已形成完整連接。動脈造影發(fā)現(xiàn)下齒槽動脈中斷,動脈末端可見細小分支發(fā)出。 組織學觀察顯示術(shù)后1個月:移植骨表層骨質(zhì)大部分已被吸收,新骨生成以微血管為中心展開;骨膜下大量未分化間充質(zhì)細胞聚集,可見軟骨細胞團塊。術(shù)后2個月:移植骨進一步吸收,仍可見到正常骨細胞形態(tài)。新生骨小梁粗大融合,連接成片,部分已礦化成熟,微血管數(shù)目較多。術(shù)后4個月:新生骨、移植骨與宿主骨已基本融為一體,新的骨髓腔開始形成,血管數(shù)量減少。 對移植骨陷窩的著色計數(shù)表明,術(shù)后1個月,移植骨有近30%骨細胞存活,2個月存活率接近20%。移植骨術(shù)后1~2個月邊緣部位的骨礦化沉積率明顯高于中間部位,也高于周圍頜骨近2倍;術(shù)后4個月移植骨各部位礦化速率與正常骨質(zhì)無明顯差異。對礦化骨小梁相關(guān)參數(shù)(TV/BV、Tb.Th和Tb.Sp)、未礦化骨基質(zhì)相關(guān)參數(shù)(OS/BS、O.Th)和骨吸收參數(shù)(N.Oc/BS、ES/BS)的形態(tài)計量學分析結(jié)果表明:術(shù)后1~2個月移植骨不同部位間上述3組參數(shù)均有明顯差異。邊緣部位在骨和骨基質(zhì)的生成方面明顯高于中間區(qū)域;而在骨吸收指標上低于中間區(qū)域。術(shù)后4個月不同部位間的成骨差異縮小,接近正常水平。從同一部位各個時間點的比較來看,無論是移植骨邊緣還是中部,3組參數(shù)均有明顯差異。微血管計數(shù)分析,移植骨近中、遠中部位各時間點微血管數(shù)目并無明顯差異,中部則處于明顯乏血管區(qū)域。術(shù)后1~2個月,近、遠中部位微血管數(shù)目均較周圍頜骨顯著增多,2個月時血管數(shù)量處于最高峰。而同期的中間部位血管數(shù)目則明顯少于周邊頜骨。術(shù)后4個月時各部位血管數(shù)目接近正常。結(jié)合血管和新生骨的計量分析結(jié)果,推測新生血管和新骨生成呈正相關(guān)關(guān)系,與骨吸收呈負相關(guān)關(guān)系。 VEGF免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)VEGF定位于血管內(nèi)皮細胞,其表達與微血管數(shù)量呈明顯量效關(guān)系。術(shù)后1~2個月,VEGF在血管內(nèi)皮細胞中強陽性表達。術(shù)后4個月呈弱陽性表達。原位雜交和免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)TGF-β1在多種組織細胞內(nèi)均有表達。術(shù)后1個月,TGF-β1在新生軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞內(nèi)呈強陽性表達;術(shù)后2個月,成骨細胞和破骨細胞內(nèi)TGF-β1仍呈強陽性表達;移植骨只有少部分有弱陽性表達;術(shù)后4個月,新生骨細胞和基質(zhì)內(nèi)有陽性表達。 上述結(jié)果表明不同時期NVBG移植骨塊均能保留部分活力,新骨在術(shù)后1個月開始大量長入,術(shù)后2個月進一步生長并持續(xù)礦化,術(shù)后4個月開始成熟改建。新骨生長以新生血管為中心展開,新骨生成與新生血管有正相關(guān)性。VEGF和TGF-β1在血管再生和新骨生成中發(fā)揮重要作用,二者之間有協(xié)同作用。 第二部分在前期游離植骨的基礎(chǔ)上,同期種植體植入。以種植體骨結(jié)合為著眼點,探討NVBG同期種植種植體骨界面和種植體周圍骨質(zhì)的生成和改建規(guī)律以及VEGF和TGF-β1在種植體骨結(jié)合中的作用。 實驗方法:選用實驗犬24只,分為2組,術(shù)前1個月拔除兩側(cè)下頜前磨牙。如上述方法形成下頜骨缺損的游離髂骨修復,A組在髂骨塊的中部和側(cè)方分別植入1枚種植體。B組將種植體與rhVEGF165和rhTGF-β1復合后再植入移植髂骨內(nèi)。犬的另一側(cè)下頜常規(guī)植入1枚種植體作為對照。術(shù)后1、2、4個月取材,行大體、X線、組織學、顯微CT觀察和種植體骨結(jié)合力測試。 實驗結(jié)果: X線觀察術(shù)后1個月,種植體周圍有明顯透光影;術(shù)后2個月,種植體周圍骨質(zhì)有輕度阻射,密度低于周圍移植骨。術(shù)后4個月,種植體與周圍骨質(zhì)大部分形成直接結(jié)合,無透射間隙存在。從種植體骨結(jié)合形成時間來看,術(shù)后1個月,BIC不足5%,術(shù)后2個月為25%左右;而同時間對照組的BIC分別為10%、35%。種植體骨界面的力學測試也證明術(shù)后1~2個月骨移植組較對照組差異明顯。術(shù)后4個月時,A、B兩組邊緣位置的BIC達到60%以上,種植體骨界面結(jié)合力接近220N,已形成較好的骨結(jié)合。M-CT骨形態(tài)計量分析表明術(shù)后各時間點A、B兩組在TV/BV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N四組參數(shù)測量上均與對照組有明顯差異;邊緣部位在術(shù)后1、2、4個月的骨質(zhì)新生和改建速度明顯高于中間部位;從同一部位不同時間分析,骨小梁呈現(xiàn)出從少到多的量和質(zhì)的累計過程,而對照組的這一進程明顯快于A、B組。從種植體周圍骨質(zhì)密度變化來看,各時間點A、B組骨小梁組織礦化密度和連接密度均小于對照組。邊緣部位各時間點骨連接密度顯著高于中間部位。VEGF和TGF-β1同時用于種植體局部,結(jié)果表明術(shù)后1、2個月A組BIC較B組顯著增高;對種植體周圍骨小梁的進一步分析表明,A組的成骨的作用較B組明顯增強。 上述試驗結(jié)果表明NVBG同期種植體植入早期(術(shù)后1~2個月),種植體骨界面以纖維連接為主,術(shù)后4個月,有效的種植體骨結(jié)合形成。邊緣部位BIC和成骨效率高于中間部位。TGF-β1和VEGF對種植體骨結(jié)合早期(術(shù)后1~2個月)有明顯的促進作用。 第三部分利用GFP-C57BL/6小鼠建立NVBG動物模型,以新生骨來源和移植骨的成骨能力為研究重點,通過觀察在不同時間點移植骨和新生骨細胞GFP表達,判斷移植骨活力和新生骨來源。 實驗方法:1、取GFP-C57BL/6小鼠脛骨,作體外成骨細胞培養(yǎng),觀察成骨細胞的繁殖能力和連續(xù)傳代對GFP表達的影響。2、取GFP-C57BL/6和C57BL/6小鼠各15只,切取GFP-C57BL/6 5mm脛骨,完整保留骨膜及部分肌肉附著,植入C57BL/6小鼠同法截骨后的骨缺損區(qū)。分別于術(shù)后3天、1、2、3、4周取材,行X線、組織學和熒光顯微鏡觀察。 實驗結(jié)果: X線觀察術(shù)后3天~1周,移植骨與宿主骨間隙明顯,未見明顯移植骨吸收。術(shù)后2~3周,移植骨邊緣隱約可見膨隆的骨痂形成,植骨間隙模糊。術(shù)后4周,移植骨與宿主形成明顯的條索樣骨性連接。組織學觀察術(shù)后3天移植骨區(qū)出血炎癥反應明顯。術(shù)后1周移植骨表面進一步吸收,破骨細胞大量增生;未分化間充質(zhì)細胞、成骨前體細胞聚集。術(shù)后2周移植區(qū)由外向內(nèi)可分為6個層次,依次為肌肉、骨膜、新生軟骨層、網(wǎng)狀骨小梁層、移植骨、移植骨骨髓腔。術(shù)后3周新生骨小梁粗大,部分與移植骨相融合。有早期的骨髓腔形成。術(shù)后4周新生骨小梁進一步融合,外層已有早期板狀骨形成,內(nèi)層與余留移植骨融合不易區(qū)分。熒光顯微鏡觀察術(shù)后各時間點移植骨周圍的肌肉一直呈現(xiàn)亮綠色熒光;新生骨小梁周圍的成骨細胞也有明顯熒光表達。移植骨骨細胞內(nèi)有部分熒光表達。 上述結(jié)果表明GFP-C57BL/6小鼠成骨細胞體外培養(yǎng)、傳代后,仍對GFP蛋白有穩(wěn)定表達。GFP-C57BL/6小鼠NVBG脛骨移植術(shù)后各時間點移植骨、肌肉、新生成骨細胞均有GFP熒光表達,充分說明在適宜的條件下NVBG移植骨并非完全經(jīng)歷“爬行替代”,移植骨自身有很強的成骨能力。移植骨膜在新骨生成中起重要作用。 本研究從多個角度、不同層面全景式的展現(xiàn)了NVBG的愈合全貌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NVBG移植骨并未完全經(jīng)歷“爬行替代”過程,NVBG同期種植在術(shù)后4月能形成較好的骨結(jié)合。這是對“爬行替代”理論的補充和修正,具有很強的臨床指導意義。實驗中首次將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠用于NVBG骨移植研究,結(jié)果表明該動物模型具有良好的直觀性和特異性;首次將VEGF和TGF-β1聯(lián)合用于NVBG同期種植,發(fā)現(xiàn)二者有明顯促進種植體骨結(jié)合的作用。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R782
【部分圖文】：

圖 1：犬 NVBG 手術(shù)過程 a 下頜骨截骨，重建板固定 b 髂骨切取 c 2.5cm 的截除骨塊和髂骨塊 d 移植髂骨固定 e 術(shù)后 2 月，傷口愈合良好- 80 -

犬NVBG下齒槽動脈造影a手術(shù)側(cè)動脈中斷b對照側(cè)動脈連續(xù)（箭頭所示）

- 82 -圖 4 犬 NVBG 組織學觀察(×100) a 術(shù)后 1 月 HE 染色 移植區(qū)間充質(zhì)細胞聚集，大量軟骨細胞出現(xiàn)，血供豐富。b 術(shù)后 1 月 三色染色 軟骨細胞聚集，逐漸向骨細胞轉(zhuǎn)變，間隙內(nèi)有大量新生血管出現(xiàn)。c 術(shù)后 2 月 三色染色 新生骨小梁粗大融合，未完全礦化成熟。 d 術(shù)后 4 月 HE 染色 移植骨與新生骨融為一體。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 韓澤民,劉寶林,于開濤,孫沫逸;非血管化游離骨移植同期種植骨活力的實驗研究[J];北京口腔醫(yī)學;2005年02期

2 金行晴,邱蔚六,林國礎(chǔ);血管化和非血管化骨移植種植體與骨結(jié)合的比較研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;1993年03期

3 趙晉龍,何黎升,劉寶林,馬秦;非血管化髂骨和下頜骨與鈦種植體結(jié)合的比較研究[J];臨床口腔醫(yī)學雜志;2004年02期

4 韓澤民,于開濤,劉寶林,孫沫逸;非血管化游離骨移植中細胞活力的實驗研究[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2004年06期

5 劉寶林,李德華;下頜骨腫瘤切除術(shù)后的功能性重建[J];實用腫瘤雜志;2000年06期

6 劉寶林;腫瘤術(shù)后頜骨缺損的功能重建[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2003年01期

7 周強,李起鴻,楊柳,柳鳳軒;糖皮質(zhì)激素誘導性股骨頭壞死模型的血管改變[J];中華外科雜志;2000年03期

本文編號：2822977