研究目的:通過對健康人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的原代培養(yǎng),測定其在健康及體外模擬牙周炎狀態(tài)下脂聯(lián)素受體(Adiponectin receptor,AdipoR)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的表達(dá),并觀察脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)對牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激HGFs免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控,以初步揭示脂聯(lián)素及其受體對牙周炎的影響,為進(jìn)一步揭示肥胖相關(guān)疾病與牙周炎相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制及輔助治療提供實驗依據(jù)。研究方法:選取自2017年03月至2017年05月因拔除埋伏阻生智齒在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科就診的患者(年齡18-24歲,平均年齡22歲),排除患有全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等病史,妊娠,吸煙,近3個月內(nèi)使用抗生素者,患者知情同意,在術(shù)中收集新鮮且色形質(zhì)健康、無明顯炎癥的的牙齦組織。(1)運(yùn)用組織塊貼壁法從體外培養(yǎng)HGFs,選取4-6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。(2)從健康HGFs中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄法合成互補(bǔ)的DNA(complementary DNA,cDNA),反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測HGFs中脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表達(dá)。(3)分別用P.g LPS、TNF-α、APN刺激HGFs 24h。細(xì)胞刺激情況如下:TNF-α50ng/ml,P.g LPS 0.1μg/ml,APN 1μg/ml,空白對照(10%FBS培養(yǎng)基)。(4)上述方法刺激細(xì)胞后,運(yùn)用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測不同時間點(diǎn)(0、0.5、12、24h)HGFs中脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表達(dá)水平。(5)分別用P.g LPS、APN+P.g LPS刺激HGFs達(dá)24h。細(xì)胞刺激的情況如下:2μg/ml P.g LPS,2μg/ml P.g LPS+1μg/ml APN,空白對照(10%FBS培養(yǎng)基)。(6)上述方法刺激細(xì)胞后,運(yùn)用real-time PCR法檢測不同時間點(diǎn)(6、8、24h)HGFs中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(Prostaglandin-E2,PGE_2)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)的mRNA表達(dá)水平。(7)采用IBM SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,做描述性分析;計數(shù)資料表示:均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差;單因素分析采用One-way ANOVA來分析,析因設(shè)計采用析因分析,當(dāng)p0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:(1)運(yùn)用組織塊貼壁法從組織塊中成功培養(yǎng)出HGFs。在顯微鏡下仔細(xì)觀察顯示:原代培養(yǎng)約6-8天后有細(xì)胞從組織塊中爬出,傳代后細(xì)胞形態(tài)為趨于一致的長梭形。免疫組化結(jié)果顯示:細(xì)胞抗角蛋白染色呈現(xiàn)陰性,抗波形絲蛋白染色呈現(xiàn)陽性,證實我們培養(yǎng)的細(xì)胞為來源于中胚層的人牙齦成纖維細(xì)胞。(2)RT-PCR顯示人牙齦成纖維細(xì)胞均表達(dá)AdipoR1和AdipoR2,其中AdipoR2條帶亮度較AdipoR1亮度更高,提示在牙齦結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體可能主要以AdipoR2為主,進(jìn)一步探討需siRNA實驗和蛋白實驗證實。(3)與空白對照組相比,TNF-α下調(diào)了HGFs的AdipoR2 mRNA表達(dá)(p0.05),P.g LPS與APN明顯上調(diào)了HGFs的AdipoR1/R2 mRNA的表達(dá)(p0.05)。(4)P.g LPS促進(jìn)HGFs分泌PGE_2、IL-6、MMP-1及TNF-α,在P.g LPS各炎性介質(zhì)最佳刺激時間點(diǎn),APN可顯著抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1(p0.05),APN可促進(jìn)P.g LPS刺激HGFs分泌PGE_2和TNF-α,但與P.g LPS對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)脂聯(lián)素受體(AdipoR1、AdipoR2)在人牙齦成纖維細(xì)胞中均有表達(dá),且主要以AdipoR2為主,提示脂聯(lián)素可以通過內(nèi)分泌方式作用于牙周組織。(2)APN可抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1,抑制病原微生物在牙周炎致病過程中所起的作用,產(chǎn)生抗炎、抗骨吸收和基質(zhì)降解等作用。。(3)在牙周炎癥狀態(tài)下,脂聯(lián)素與其受體作用效能下降,致使已有的牙周炎癥進(jìn)一步加重,及時清創(chuàng)治療和輔助APN等局部藥物治療對于控制炎癥、防止病情加重意義重大。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R781.42
【部分圖文】：

一、HGFs 中脂聯(lián)素受體的表達(dá)及 TNF-α、P.g L醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 對其影響 原代培養(yǎng)的 HGFs 的形態(tài)學(xué)觀察在靜置 4 小時后，我們可見大多數(shù)的牙齦組織貼附在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底后，在倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣隱隱約約有成纖維細(xì)胞樣呈梭形（圖 1A），在游出細(xì)胞的頭部我們可見到其偽足結(jié)構(gòu)十分清晰，并極性很強(qiáng)，在生長很密集的地方，我們可以看到細(xì)胞排列呈現(xiàn)十分明形狀，同時伴隨著原代培養(yǎng)時間的延長，牙齦組織塊四周顯示細(xì)胞密，并彼此融合同時與從相鄰的組織塊爬出的細(xì)胞相互交匯（圖 1B）至培養(yǎng)瓶 80%時，即可傳代，傳代后我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈長梭形，部分原代培養(yǎng)和傳代生長的 HGFs 細(xì)胞均呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣，而且在其四看到多個突起，在細(xì)胞的中央可見圓形或卵圓形的細(xì)胞核，核內(nèi)核細(xì)胞呈分裂相，細(xì)胞整體走向為放射狀、漩渦狀走行（圖 1C、D）果

RT-PCR檢測在健康HGFs中AdipoR1、AdipoR2的表達(dá)Figure3TheexpressionofAdipoR1andAdipoR2inhealthyHGFsviaRT-PCR

圖 2 HGFs 組織來源的鑒定（免疫組織化學(xué) SP 法)Figure 2 Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP) 健康 HGFs 脂聯(lián)素受體的表達(dá).1 RNA 樣品純度的測定根據(jù) 260nm 及 280nm 處吸光度數(shù)值計算:OD260/OD280=0.496/0.271抽提的 RNA 純度是較高的。.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的結(jié)果HGFs 有 AdipoR1、AdipoR2 的表達(dá)，且瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)基因片段與預(yù)期一致（圖 3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張欣;徐蓓蕓;俞立英;;脂聯(lián)素對Ⅱ型糖尿病患者伴牙周炎的影響[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2011年05期

2 于艷玲;許麗華;王俊霞;尤紅煜;楊冬茹;;內(nèi)毒素對牙齦成纖維細(xì)胞增殖活性及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的影響[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年01期

3 李春霖,龔燕平,田慧,陸菊明,李明,肖或君,母義明,潘長玉;脂聯(lián)素受體在正常Wistar大鼠各組織的分布和表達(dá)[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2005年08期

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉洋;羅格列酮對牙周炎大鼠牙齦組織ADPR1 mRNA和ADPR2 mRNA表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2016年

本文編號：2822472