目的:探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)體外對山羊不同類型髁狀突囊內(nèi)骨折后的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影響,為后期臨床上髁囊內(nèi)骨折治療提供參考依據(jù)。方法:16只健康山羊雙側(cè)關(guān)節(jié)隨機分為4組,8只山羊為左側(cè)A型髁突囊內(nèi)骨折組(A組)+右側(cè)B型髁突囊內(nèi)骨折組(B組),另外8只為左側(cè)C型髁突囊內(nèi)骨折組(C組)+右側(cè)對照組(D組),術(shù)后1月、2月、3月、6月分別在各時間點全麻處死4只,分離、提取第3代骨髓間充質(zhì)干細胞進行rhBMP-2誘導,測定第1~7天的增殖狀況(MTT法),測定第7天、10天的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及骨鈣素(osteocalcin,OC)含量,培養(yǎng)1周后ALP染色。結(jié)果:與非誘導組比較,A、B、C、D組BMSCs使用rhBMP-2誘導劑后,同時間同骨折類型均出現(xiàn)的ALP活性及OC含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);術(shù)后1、2、3、6月,B組誘導后ALP活性及OC含量較誘導后A組、C組及D組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);術(shù)后1、2、3、6月,A組、C組及D組ALP活性及OC含量對比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:體外分離培養(yǎng)的山羊髁突BMSCs,在誘導劑rhBMP-2的作用下BMSCs表現(xiàn)出明顯的成骨活性;在誘導劑rhBMP-2的作用下,B型髁突囊內(nèi)骨折后的髁突BMSCs在術(shù)后1、2、3及6月成骨活性明顯高于A型、C型髁突囊內(nèi)骨折組及對照組。
【學位單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R782.4
【部分圖文】：

新疆醫(yī)科大學碩士學位論文2 研究內(nèi)容及研究方法2.1 動物模型的制備實驗前山羊顆粒飼料喂養(yǎng) 1 周，術(shù)前 24 小時禁食水，麻醉前稱重，使的氯胺酮－速眠新肌肉按 1.5 ml/ kg 行腹腔注射麻醉。所有山羊關(guān)節(jié)區(qū)手術(shù)實驗員完成。麻醉生效后，山羊仰臥位固定于實驗臺上。雙側(cè)耳前區(qū)備皮鋪無菌巾，在顴弓下 0.5 cm 設計 4.0 cm 的平行切口，逐層切開至肌層表面離至髁狀突頸部，不分離關(guān)節(jié)囊附著得情況下切開關(guān)節(jié)囊小口，暴露部分后用小骨刀敲擊，分別形成 A 組、B 組、C 組形成 A 型、B 型、C 型髁突（圖 1），D 組僅切開皮膚及皮下組織，顯露并打開關(guān)節(jié)囊上、下腔。造模血，大量生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，分層縫合創(chuàng)面，留置橡皮片，術(shù)畢肌注慶大霉素術(shù)區(qū)加壓包扎，術(shù)后即刻 CT 等影像學檢查明確手術(shù)效果。實驗山羊麻醉回圈養(yǎng)，術(shù)后 48 小時拆除術(shù)區(qū)加壓包扎裝置及引流片，術(shù)后 7 天拆除術(shù)區(qū)后先用顆粒軟飼料喂養(yǎng)，2 周后改用正常顆粒飼料喂養(yǎng)。A B C

1 術(shù)后山羊的情況術(shù)后所有山羊術(shù)區(qū)切口愈合良好，未發(fā)生感染情況，16 只山羊均活到術(shù)月，16 只山羊均進入實驗研究。2 BMSCs 生長形態(tài)變化倒置顯微鏡下，山羊的 BMSCs 原代接種后，呈現(xiàn)大小不一的單個圓形細量的懸浮紅細胞向混雜與培養(yǎng)液中。培養(yǎng) 24 小時可見少量細胞出現(xiàn)貼壁。培小時，懸浮細胞明顯減少，大部分細胞沉積在瓶底，具有強折光性，多數(shù)呈壁生長分散于大量的雜細胞中，貼壁細胞出現(xiàn)伸展變形的現(xiàn)象，伸出偽足，角形。隨著換液，貼壁細胞逐漸增多，7-10d 后可見明顯細胞集落，呈旋渦狀傳代后，細胞得以純化，細胞形態(tài)呈現(xiàn)三角形、梭型及少量的多角形細胞，規(guī)則。傳至第 3 代時，細胞呈長梭型，形態(tài)一致，貼壁及增長速度逐漸加快后 4h 小時即可貼壁，生長密集，分布均勻，整體呈漩渦狀或放射狀排列，細細胞核清晰可見。使用 rhBMP-2 誘導劑后 BMSCs 的生長速度明顯減慢，體積形態(tài)可多樣，梭形或多角形，細胞胞質(zhì)內(nèi)可見散在發(fā)布的顆粒狀物質(zhì)及空泡（cab c d

a b c d圖 3 對照組（D 組）第三代骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物檢測結(jié)果及誘導后 ALP 染色結(jié)果為 CD29 染色染色結(jié)果，胞漿呈黃褐色；圖 b 為 CD44 染色染色結(jié)果，胞漿呈黃褐色；圖 c 為染色染色結(jié)果，胞漿未著色；圖 d 為 ALP 染色結(jié)果，細胞呈現(xiàn)藍紫色。)（×200 倍）Figure 3 The detection results of surface markers of third-generation bone marrow mesencstem cells and results ofALP staining after induction in control group (group D) (×2004 MTT 比色法檢測細胞的增殖并繪制生長曲線通過第 P 代 BMSCs 的 MTT 檢測并繪制生長曲線（如圖 4）發(fā)現(xiàn)，此次實驗的細胞增殖能力強，第 2～3d 為潛伏期，在第 2～3d 基本進入生長對數(shù)期，第右到達生長峰值，之后進入平臺期，生長速度趨向于穩(wěn)定。圖 4 各組第三代骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線

【參考文獻】

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本文編號：2816791