發(fā)布時(shí)間：2020-09-10 18:27

　　 齲病是危害人類口腔健康的常見(jiàn)病,變異鏈球菌(簡(jiǎn)稱變鏈菌)是公認(rèn)的主要致齲菌,對(duì)其研究目前已深入到分子水平。但是,長(zhǎng)期以來(lái)的絕大多數(shù)研究是以懸浮于培養(yǎng)基中的浮游狀態(tài)細(xì)胞作為研究對(duì)象,而在自然條件下,變鏈菌在口腔中是以牙菌斑這一典型的生物膜結(jié)構(gòu)形式存在。牙齒萌出到口腔后,變鏈菌即在牙面黏附和聚集,最終形成復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)以適應(yīng)不斷變化的口腔環(huán)境,并在條件合適時(shí)致齲。因此,研究變鏈菌生物膜的致齲特性對(duì)于進(jìn)一步闡明齲病發(fā)病機(jī)制、疾病風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估以及生態(tài)防治均有重要意義。同時(shí),隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和激光共聚焦掃描顯微鏡的問(wèn)世,近來(lái)實(shí)時(shí)、完整、動(dòng)態(tài)地觀察生物膜已成為可能。 另一方面,隨著對(duì)變鏈菌致齲生物學(xué)性能的廣泛、深入研究,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在致齲過(guò)程中變鏈菌的數(shù)量并不是唯一的決定因素,其菌株間存在的致齲能力差異也是重要的影響因素,因此,了解變鏈菌臨床株間致齲能力的差異將有助于提高齲病風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。為研究變鏈菌菌株間致齲性的差異及其原因,本課題組前期已分別自高齲患者和無(wú)齲健康人口內(nèi)分離獲得血清C型變鏈菌593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株,兩菌株不僅在體內(nèi)表現(xiàn)出致齲差異,通過(guò)基因型分析、系列體外致齲實(shí)驗(yàn)和蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),其基因型、體外致齲能力和功能蛋白表達(dá)均存在差異。在此基礎(chǔ)上,本研究利用激光共聚焦掃描顯微鏡和熒光染色技術(shù),以及掃描電鏡對(duì)變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175、593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株的生物膜分別進(jìn)行定性、定位和定量的比較研究。本研究包括四部分實(shí)驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)一變異鏈球菌生物膜形成能力差異研究 目的:了解變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175、593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株各自體外生物膜的連續(xù)動(dòng)態(tài)形成演替過(guò)程及其差異。方法:在聚苯乙烯塑料片上分別形成0.5,1,1.5,2,4,6,12,16,18,20,72小時(shí)變鏈菌生物膜標(biāo)本,應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡及死菌和活菌熒光染色技術(shù)相結(jié)合的方法,對(duì)各時(shí)間段的菌斑生物膜進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)觀察,通過(guò)對(duì)斷層掃描圖像的重建得到生物膜的三維圖像,測(cè)量生物膜厚度,計(jì)算生物膜中細(xì)菌密度和活菌百分比。結(jié)果:各菌株在聚苯乙烯塑料片表面均可黏附形成具有空間立體結(jié)構(gòu),形態(tài)多樣的致密生物膜,其主要由非均質(zhì)分布的死細(xì)菌和活細(xì)菌組成,且同菌株不同層面以及不同時(shí)間段生物膜的細(xì)菌密度和死菌活菌比均不同。不同菌株同時(shí)間段形成的生物膜厚度、細(xì)菌密度、活菌百分比也存在差異。結(jié)論:變鏈菌生物膜是由大量微菌落組成,具一定厚度、形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、不均質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。593號(hào)臨床株的生物膜形成能力強(qiáng)于18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175,18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175間差異無(wú)顯著意義。 實(shí)驗(yàn)二變異鏈球菌生物膜狀態(tài)黏附能力差異研究 目的:了解變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175、593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株在體外黏附、聚集形成生物膜的過(guò)程及其表面形態(tài)和差異。方法:在聚苯乙烯塑料片上分別形成2,3,4,6,12,20小時(shí)變鏈菌生物膜標(biāo)本,用掃描電鏡觀察各時(shí)間段生物膜標(biāo)本的表面形態(tài)和變鏈菌黏附情況。結(jié)果:各時(shí)間段變鏈菌不同菌株對(duì)聚苯乙烯塑料片的黏附能力不同,其形成的生物膜表面形態(tài)也存在差異。結(jié)論:593號(hào)臨床株的黏附能力強(qiáng)于18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175,18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175間未見(jiàn)明顯差異。 實(shí)驗(yàn)三變異鏈球菌生物膜耐酸能力差異研究 目的:了解變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175、593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株生物膜的耐酸能力及其差異。方法:(1)首先在聚苯乙烯塑料片上分別形成幼齡生物膜(3小時(shí))、成熟生物膜(20小時(shí))標(biāo)本,然后將不同時(shí)間段形成的生物膜標(biāo)本隨機(jī)分成預(yù)酸化組和非預(yù)酸化組。預(yù)酸化組先將生物膜標(biāo)本置于pH5.5的TPY液體培養(yǎng)基中預(yù)酸化3小時(shí),然后再將之置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強(qiáng)酸化30min;非預(yù)酸化組則直接將生物膜標(biāo)本置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強(qiáng)酸化30min。酸化后的標(biāo)本采用熒光染色技術(shù)分別對(duì)死菌和活菌進(jìn)行染色,然后通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察;(2)在聚苯乙烯塑料片上形成20小時(shí)變鏈菌生物膜標(biāo)本,然后將之隨機(jī)分成饑餓組和非饑餓組。饑餓組置于PBS液緩沖液中(無(wú)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)),非饑餓組置于TPY液體培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)24小時(shí)后取出生物膜標(biāo)本,再置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強(qiáng)酸化30min,然后同上法觀察生物膜標(biāo)本。結(jié)果:(1)經(jīng)過(guò)預(yù)酸化處理的幼齡生物膜(3小時(shí))、成熟生物膜(20小時(shí))標(biāo)本經(jīng)強(qiáng)酸化后的活菌比例均較非預(yù)酸化組增高,其中593號(hào)臨床株生物膜的活菌比例顯著高于其他菌株。(2)無(wú)論是否經(jīng)過(guò)預(yù)酸化處理,幼齡生物膜(3小時(shí))標(biāo)本酸化后活菌數(shù)量下降較成熟生物膜(20小時(shí))標(biāo)本酸化后活菌數(shù)量下降更為顯著,其中593號(hào)臨床株生物膜活菌數(shù)量下降較其他菌株為少。(3)饑餓生物膜酸化后活菌比例顯著高于非饑餓生物膜,其中593號(hào)臨床株的活菌比例顯著高于其他菌株。結(jié)論:變鏈菌生物膜經(jīng)過(guò)預(yù)酸化可具有更強(qiáng)的耐酸能力;幼齡生物膜(3小時(shí))的耐酸能力較成熟生物膜(20小時(shí))弱;饑餓可增加變鏈菌生物膜的耐酸能力;各狀態(tài)下593號(hào)臨床株生物膜的耐酸能力均強(qiáng)于18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175,18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175間差異無(wú)顯著意義。 實(shí)驗(yàn)四變異鏈球菌生物膜合成胞外多糖能力差異研究 目的:了解變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175、593號(hào)臨床株和18號(hào)臨床株生物膜不同時(shí)間段合成胞外多糖的變化情況及其差異。方法:(1)在聚苯乙烯塑料片上分別形成3,12,20小時(shí)變鏈菌生物膜標(biāo)本,用熒光染料FITC-ConA對(duì)胞外多糖進(jìn)行染色,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。(2)將變鏈菌分別進(jìn)行靜置培養(yǎng),以得到生物膜狀態(tài)生長(zhǎng)的變鏈菌,蒽酮法測(cè)量生物膜狀態(tài)下不同時(shí)間段變鏈菌合成胞外多糖能力的差異。結(jié)果:同菌株不同時(shí)間段生物膜胞外多糖的分泌量和分布不同,同時(shí)不同菌株間也存在差異。結(jié)論:生物膜形成過(guò)程的不同階段其合成胞外多糖的能力不同;相同條件下,593號(hào)臨床株生物膜合成胞外多糖的能力強(qiáng)于18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175,18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175間差異無(wú)顯著意義。 綜上所述,593號(hào)臨床株的生物膜形成能力以及生物膜狀態(tài)黏附能力、耐酸能力、合成胞外多糖能力均強(qiáng)于18號(hào)臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175。而593號(hào)臨床株在與致齲力密切相關(guān)的四個(gè)方面均表現(xiàn)出的更強(qiáng)能力,這可能也就是593號(hào)臨床株在臨床上表現(xiàn)出高致齲性能的部分原因。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R781.1
【部分圖文】：

1-1 變鏈菌在 TPY 平板上的菌落形態(tài)（肉眼觀）圖 1-2 變鏈菌革蘭氏染色圖（10×100）2 菌株革蘭氏染色結(jié)果（圖 1-2）：染色后油鏡（10×100）下觀察可見(jiàn) 593 號(hào)臨床株，18 號(hào)臨床株，變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC 25175 菌體呈紫色，為 G+小球菌，呈長(zhǎng)鏈狀或短鏈狀，成對(duì)或分散排列。隨機(jī)選擇觀察的各視野菌體形態(tài)均勻一致，未見(jiàn)污染。3 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175和臨床分離株（18號(hào)和593號(hào)臨床株）生物膜結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：3.1 背景觀察：3.1.1 空白聚苯乙烯塑料片熒光染色后，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其不能發(fā)出熒光，即沒(méi)有綠光和紅光，整個(gè)視野為黑色（圖1-3）。3.1.2 變鏈菌生物膜不經(jīng)過(guò)熒光染色，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡直接觀察，發(fā)現(xiàn)整個(gè)視野沒(méi)有紅光和綠光，即說(shuō)明變鏈菌自身沒(méi)有發(fā)出熒光的物質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖1-4）。

1-1 變鏈菌在 TPY 平板上的菌落形態(tài)（肉眼觀）圖 1-2 變鏈菌革蘭氏染色圖（10×100）2 菌株革蘭氏染色結(jié)果（圖 1-2）：染色后油鏡（10×100）下觀察可見(jiàn) 593 號(hào)臨床株，18 號(hào)臨床株，變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC 25175 菌體呈紫色，為 G+小球菌，呈長(zhǎng)鏈狀或短鏈狀，成對(duì)或分散排列。隨機(jī)選擇觀察的各視野菌體形態(tài)均勻一致，未見(jiàn)污染。3 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175和臨床分離株（18號(hào)和593號(hào)臨床株）生物膜結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：3.1 背景觀察：3.1.1 空白聚苯乙烯塑料片熒光染色后，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其不能發(fā)出熒光，即沒(méi)有綠光和紅光，整個(gè)視野為黑色（圖1-3）。3.1.2 變鏈菌生物膜不經(jīng)過(guò)熒光染色，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡直接觀察，發(fā)現(xiàn)整個(gè)視野沒(méi)有紅光和綠光，即說(shuō)明變鏈菌自身沒(méi)有發(fā)出熒光的物質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖1-4）。

3.1 背景觀察：3.1.1 空白聚苯乙烯塑料片熒光染色后，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其不能發(fā)出熒光，即沒(méi)有綠光和紅光，整個(gè)視野為黑色（圖1-3）。3.1.2 變鏈菌生物膜不經(jīng)過(guò)熒光染色，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡直接觀察，發(fā)現(xiàn)整個(gè)視野沒(méi)有紅光和綠光，即說(shuō)明變鏈菌自身沒(méi)有發(fā)出熒光的物質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖1-4）。圖1-3 空白聚苯乙烯塑料片熒光染色 圖1-4 變鏈菌生物膜不經(jīng)過(guò)熒光染色CLSM觀察（10×10） 直接CLSM觀察（10×10）3.2 變鏈菌生物膜結(jié)構(gòu)觀察：實(shí)驗(yàn)中各時(shí)間段變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175，18號(hào)臨

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2816158