第一章口腔黏膜下纖維性變新靶標(biāo)分子的定量分析研究 研究目的:(1)在前期實(shí)驗(yàn)建立的口腔黏膜下纖維性變[oralsubmucous fibrosis(OSF)]頰黏膜與口腔正常頰黏膜[normal buccalmucosa(NBM)]差異基因表達(dá)譜中篩選出顯著性更強(qiáng)的差異基因,并在其中選取3個(gè)上調(diào)差異變化最大的基因和2個(gè)下調(diào)差異變化最大的基因作為OSF候選靶標(biāo)基因;(2)分別研究5個(gè)候選基因在OSF頰黏膜和正常頰黏膜中mRNA和蛋白水平的定量表達(dá)差異,并以此驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。 研究方法:(1)將前期試驗(yàn)建立的15339個(gè)OSF差異表達(dá)基因(8184個(gè)上調(diào)基因和7155個(gè)下調(diào)基因)以差異倍數(shù)變化值[foldchange value(FCV)]從大至小排序,同時(shí)以上調(diào)基因FCV大于2、下調(diào)基因FCV小于0.5、顯著性差異值q小于0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出顯著性差異基因,并在其中選取3個(gè)上調(diào)FCV最大和2個(gè)下調(diào)FCV最小的基因作為候選基因;再對篩選的顯著性差異基因進(jìn)行分層聚類分析[hierarchical clustering analysis(HCA)];(2)將OSF頰黏膜和正常頰黏膜組織標(biāo)本提取總mRNA后,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)[reverse transcriptase-PCR(RT-PCR)]方法研究5個(gè)候選基因在其中的mRNA表達(dá)差異,并對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;(3)將OSF頰黏膜和正常頰黏膜組織標(biāo)本提取總蛋白后,利用Western blotting方法研究5個(gè)候選靶標(biāo)蛋白在其中的蛋白表達(dá)差異。 研究結(jié)果:(1)最終共篩選出790個(gè)顯著性差異基因,其中上調(diào)基因661個(gè)、下調(diào)基因129個(gè);3個(gè)上調(diào)FCV最大的基因分別是:兜甲蛋白[loricrin(LOR)]基因、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白[cartilage oligomericmatrix prorein(COMP)]基因和趨化因子9[Cys-X-Cys ligand 9(CXCL9)]基因;2個(gè)下調(diào)FCV最小的基因分別是:角蛋白[keratin 19(KRT19)]基因和細(xì)胞色素450 3A5[cytochrome P450 3A5(CYP 3A5)]基因;分層聚類分析結(jié)果顯示這些顯著差異基因能有效區(qū)分OSF頰黏膜組織和正常頰黏膜組織;(2)RT-PCR結(jié)果顯示:LOR、COMP和CXCL9基因在OSF組中的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組(P＜0.05);KPT19和CYP 3A5基因在OSF組中的mRNA表達(dá)水平明顯低于正常組(P＜0.05),從而驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性;(2)Western blotting結(jié)果顯示:COMP和CXCL9在OSF組中的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組(P＜0.05);KRT19和CYP 3A5在OSF組中的蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組(P＜0.05);而由于LOR本身具有極度難溶的特性,本次實(shí)驗(yàn)并沒有得到LOR在兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)。 研究結(jié)論:(1)OSF的致病機(jī)理是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程,眾多不同的相關(guān)基因參與其中;而在本研究中最值得關(guān)注的5個(gè)基因分別與OSF組織細(xì)胞物理防御能力、膠原合成、炎癥細(xì)胞趨化、上皮細(xì)胞更新能力和細(xì)胞毒物代謝能力5種重要細(xì)胞功能緊密相關(guān);(2)5個(gè)候選基因在OSF組織中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平(除LOR外)均顯著不同于正常頰黏膜組織,并且差異趨勢與基因芯片結(jié)果一致,提示這些基因確實(shí)在OSF發(fā)病致病過程中發(fā)揮了重要作用,同時(shí)也驗(yàn)證了前期試驗(yàn)基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。 第二章口腔黏膜下纖維性變新靶標(biāo)蛋白免疫組織化學(xué)定性分析 研究目的:(1)研究5個(gè)候選靶標(biāo)蛋白在OSF頰黏膜中的組織分布和細(xì)胞定位;(2)分析該5個(gè)候選靶標(biāo)蛋白在OSF中的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系,并探討它們兩兩之間的表達(dá)關(guān)聯(lián)。 研究方法:(1)收集66例OSF頰黏膜和14例正常頰黏膜組織石蠟標(biāo)本,利用免疫組織化學(xué)技術(shù)[immunohistochemistry(IHC)]將5個(gè)候選靶標(biāo)蛋白分別與其對應(yīng)的抗體結(jié)合并顯色,然后在顯微鏡下分別觀察5種蛋白在OSF組織或正常頰粘膜組織中的組織分布和細(xì)胞定位;(2)利用卡方檢驗(yàn)計(jì)算5個(gè)靶標(biāo)分子在OSF組織中的陽性染色率與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,并計(jì)算它們兩兩之間表達(dá)關(guān)聯(lián)的方向及強(qiáng)度。 研究結(jié)果:(1)LOR在正常頰黏膜中呈陰性表達(dá);而在42例(63.6%)OSF頰黏膜棘層上部和(或)表層的細(xì)胞胞漿和(或)胞核中呈棕黃色陽性染色;(2)COMP在正常頰黏膜中呈陰性表達(dá);而在36例(54.5%)OSF組織固有層和(或)黏膜下層呈強(qiáng)陽性表達(dá);(3)CXCL9在正常組中呈陰性表達(dá);而在43例(65.2%)OSF組織固有層和黏膜下層淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中呈強(qiáng)陽性表達(dá);(4)14例(100%)正常頰黏膜基底細(xì)胞胞漿均呈KRT19強(qiáng)陽性表達(dá);只有7例(10.6%)OSF基底細(xì)胞呈現(xiàn)KRT19弱陽性表達(dá),其余為陰性;(5)CYP 3A5在12例(85.7%)正常頰黏膜棘細(xì)胞胞膜和(或)胞漿,以及14例(100%)正常頰黏膜內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中呈陽性表達(dá);其只在5例(7.6%)OSF頰黏膜上皮棘細(xì)胞和33例(50%)OSF頰黏膜粘膜下層內(nèi)皮細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá),其余為陰性表達(dá)。(6)LOR在中期OSF組織中的陽性表達(dá)率顯著高于早期(P＜0.05);COMP陽性表達(dá)率與咀嚼檳榔時(shí)間(P＜0.05)和病理分期(P＜0.05)正相關(guān);而CYP 3A5陽性表達(dá)率與OSF組織病理分期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);5個(gè)候選靶標(biāo)蛋白中只有COMP陽性表達(dá)率與CYP 3A5陽性表達(dá)率之間存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的負(fù)相關(guān)性(P＜0.05),關(guān)聯(lián)強(qiáng)度r=—0.24。 研究結(jié)論:5個(gè)候選靶標(biāo)分子分別定位于OSF頰黏膜上皮層和黏膜下層,能夠有助于解釋OSF特征性病理改變形成的機(jī)制,并且提示黏膜上皮層某些特異分子的表達(dá)改變在OSF致病過程中同樣發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R781.5
【部分圖文】：

雙蒸水調(diào)至100而20)考馬斯亮藍(lán)溶液考馬斯亮藍(lán)(G一250)100哩95%乙醇50ml50ml磷酸100ml雙蒸水調(diào)至1000而濾紙過濾，4℃保存2.6方法步驟2.6.1顯著性差異基因的篩選課題組前期實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)已經(jīng)建立了OSF頰勃膜和正常頰豁膜中15339個(gè)檢測基因的差異表達(dá)譜，結(jié)果以Excel文件形式保存，上調(diào)基因文件為為SAM扁UP--resuh.xls文件，下調(diào)基因文件為sAM‘DoWNJesult.xls。在Mieroso且OfficeExcel2003程序中將文件打開，其中有8184個(gè)檢測基因呈上調(diào)狀態(tài)(圖1一l)，7155個(gè)檢測基因呈下調(diào)狀態(tài)(圖1一2):

Excel表格中的H縱列(q一value列)將該列全部選定(選定后該縱列為淺藍(lán)色)，如圖l一3;圖1一3選定上調(diào)基因的q一value縱列(部分)2)在“數(shù)據(jù)”選項(xiàng)的下拉菜單中點(diǎn)擊“排序”選項(xiàng)，以q值為排序目標(biāo)進(jìn)行升序排序，如圖l一4:l2

12810218900_at名孟』衛(wèi)旦g口通生一0.00164一0.000381， 0193215.9099375.36968218900_a釗1206弓 218104at218104at一0.00203一0.000550_9718心 315.9099375.3699721810心at圖1一2原始差異基因中7155個(gè)下調(diào)基因(部分)選定如下條件為顯著性差異基因篩選條件:①顯著性差異值(q一value)小于0.01;②上調(diào)基因的差異倍數(shù)變化值【 foklchangevalue(Fcv)」大于2;③下調(diào)基因FCV小于0.5。以8184個(gè)上調(diào)基因文件 SAMUPresult.xls為例，篩選顯著性上調(diào)基因具體步驟如下:1)在 MicrosoftOffieeExeel2003程序中將文件 SAMUPresult.xls打開，點(diǎn)擊Excel表格中的H縱列(q一value列)將該列全部選定(選定后該縱列為淺藍(lán)色)，如圖l一3;圖1一3選定上調(diào)基因的q一value縱列(部分)2)在“數(shù)據(jù)”選項(xiàng)的下拉菜單中點(diǎn)擊“排序”選項(xiàng)，以q值為排序目標(biāo)進(jìn)行升序排序，如圖l一4:l2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 賀智晶;口腔黏膜下纖維性變病例蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中南大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 趙志立;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在口腔黏膜下纖維性變癌變中的定量研究[D];中南大學(xué);2012年

本文編號：2814692