第一章口腔黏膜下纖維性變新靶標分子的定量分析研究 研究目的:(1)在前期實驗建立的口腔黏膜下纖維性變[oralsubmucous fibrosis(OSF)]頰黏膜與口腔正常頰黏膜[normal buccalmucosa(NBM)]差異基因表達譜中篩選出顯著性更強的差異基因,并在其中選取3個上調(diào)差異變化最大的基因和2個下調(diào)差異變化最大的基因作為OSF候選靶標基因;(2)分別研究5個候選基因在OSF頰黏膜和正常頰黏膜中mRNA和蛋白水平的定量表達差異,并以此驗證基因芯片結(jié)果的準確性。 研究方法:(1)將前期試驗建立的15339個OSF差異表達基因(8184個上調(diào)基因和7155個下調(diào)基因)以差異倍數(shù)變化值[foldchange value(FCV)]從大至小排序,同時以上調(diào)基因FCV大于2、下調(diào)基因FCV小于0.5、顯著性差異值q小于0.01為標準篩選出顯著性差異基因,并在其中選取3個上調(diào)FCV最大和2個下調(diào)FCV最小的基因作為候選基因;再對篩選的顯著性差異基因進行分層聚類分析[hierarchical clustering analysis(HCA)];(2)將OSF頰黏膜和正常頰黏膜組織標本提取總mRNA后,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應[reverse transcriptase-PCR(RT-PCR)]方法研究5個候選基因在其中的mRNA表達差異,并對基因芯片結(jié)果進行驗證;(3)將OSF頰黏膜和正常頰黏膜組織標本提取總蛋白后,利用Western blotting方法研究5個候選靶標蛋白在其中的蛋白表達差異。 研究結(jié)果:(1)最終共篩選出790個顯著性差異基因,其中上調(diào)基因661個、下調(diào)基因129個;3個上調(diào)FCV最大的基因分別是:兜甲蛋白[loricrin(LOR)]基因、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白[cartilage oligomericmatrix prorein(COMP)]基因和趨化因子9[Cys-X-Cys ligand 9(CXCL9)]基因;2個下調(diào)FCV最小的基因分別是:角蛋白[keratin 19(KRT19)]基因和細胞色素450 3A5[cytochrome P450 3A5(CYP 3A5)]基因;分層聚類分析結(jié)果顯示這些顯著差異基因能有效區(qū)分OSF頰黏膜組織和正常頰黏膜組織;(2)RT-PCR結(jié)果顯示:LOR、COMP和CXCL9基因在OSF組中的mRNA表達水平明顯高于正常組(P＜0.05);KPT19和CYP 3A5基因在OSF組中的mRNA表達水平明顯低于正常組(P＜0.05),從而驗證了基因芯片結(jié)果的準確性;(2)Western blotting結(jié)果顯示:COMP和CXCL9在OSF組中的蛋白表達水平明顯高于正常組(P＜0.05);KRT19和CYP 3A5在OSF組中的蛋白表達水平明顯低于正常組(P＜0.05);而由于LOR本身具有極度難溶的特性,本次實驗并沒有得到LOR在兩組具有統(tǒng)計學意義的差異表達。 研究結(jié)論:(1)OSF的致病機理是一個多因素、多步驟的復雜過程,眾多不同的相關基因參與其中;而在本研究中最值得關注的5個基因分別與OSF組織細胞物理防御能力、膠原合成、炎癥細胞趨化、上皮細胞更新能力和細胞毒物代謝能力5種重要細胞功能緊密相關;(2)5個候選基因在OSF組織中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平(除LOR外)均顯著不同于正常頰黏膜組織,并且差異趨勢與基因芯片結(jié)果一致,提示這些基因確實在OSF發(fā)病致病過程中發(fā)揮了重要作用,同時也驗證了前期試驗基因芯片結(jié)果的準確性。 第二章口腔黏膜下纖維性變新靶標蛋白免疫組織化學定性分析 研究目的:(1)研究5個候選靶標蛋白在OSF頰黏膜中的組織分布和細胞定位;(2)分析該5個候選靶標蛋白在OSF中的表達與患者臨床病理參數(shù)的關系,并探討它們兩兩之間的表達關聯(lián)。 研究方法:(1)收集66例OSF頰黏膜和14例正常頰黏膜組織石蠟標本,利用免疫組織化學技術[immunohistochemistry(IHC)]將5個候選靶標蛋白分別與其對應的抗體結(jié)合并顯色,然后在顯微鏡下分別觀察5種蛋白在OSF組織或正常頰粘膜組織中的組織分布和細胞定位;(2)利用卡方檢驗計算5個靶標分子在OSF組織中的陽性染色率與患者臨床病理參數(shù)的相關性,并計算它們兩兩之間表達關聯(lián)的方向及強度。 研究結(jié)果:(1)LOR在正常頰黏膜中呈陰性表達;而在42例(63.6%)OSF頰黏膜棘層上部和(或)表層的細胞胞漿和(或)胞核中呈棕黃色陽性染色;(2)COMP在正常頰黏膜中呈陰性表達;而在36例(54.5%)OSF組織固有層和(或)黏膜下層呈強陽性表達;(3)CXCL9在正常組中呈陰性表達;而在43例(65.2%)OSF組織固有層和黏膜下層淋巴細胞和內(nèi)皮細胞胞漿中呈強陽性表達;(4)14例(100%)正常頰黏膜基底細胞胞漿均呈KRT19強陽性表達;只有7例(10.6%)OSF基底細胞呈現(xiàn)KRT19弱陽性表達,其余為陰性;(5)CYP 3A5在12例(85.7%)正常頰黏膜棘細胞胞膜和(或)胞漿,以及14例(100%)正常頰黏膜內(nèi)皮細胞胞漿中呈陽性表達;其只在5例(7.6%)OSF頰黏膜上皮棘細胞和33例(50%)OSF頰黏膜粘膜下層內(nèi)皮細胞中呈弱陽性表達,其余為陰性表達。(6)LOR在中期OSF組織中的陽性表達率顯著高于早期(P＜0.05);COMP陽性表達率與咀嚼檳榔時間(P＜0.05)和病理分期(P＜0.05)正相關;而CYP 3A5陽性表達率與OSF組織病理分期呈負相關(P＜0.05);5個候選靶標蛋白中只有COMP陽性表達率與CYP 3A5陽性表達率之間存在具有統(tǒng)計學意義的負相關性(P＜0.05),關聯(lián)強度r=—0.24。 研究結(jié)論:5個候選靶標分子分別定位于OSF頰黏膜上皮層和黏膜下層,能夠有助于解釋OSF特征性病理改變形成的機制,并且提示黏膜上皮層某些特異分子的表達改變在OSF致病過程中同樣發(fā)揮了重要作用。
【學位單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R781.5
【部分圖文】：

雙蒸水調(diào)至100而20)考馬斯亮藍溶液考馬斯亮藍(G一250)100哩95%乙醇50ml50ml磷酸100ml雙蒸水調(diào)至1000而濾紙過濾，4℃保存2.6方法步驟2.6.1顯著性差異基因的篩選課題組前期實驗利用基因芯片技術已經(jīng)建立了OSF頰勃膜和正常頰豁膜中15339個檢測基因的差異表達譜，結(jié)果以Excel文件形式保存，上調(diào)基因文件為為SAM扁UP--resuh.xls文件，下調(diào)基因文件為sAM‘DoWNJesult.xls。在Mieroso且OfficeExcel2003程序中將文件打開，其中有8184個檢測基因呈上調(diào)狀態(tài)(圖1一l)，7155個檢測基因呈下調(diào)狀態(tài)(圖1一2):

Excel表格中的H縱列(q一value列)將該列全部選定(選定后該縱列為淺藍色)，如圖l一3;圖1一3選定上調(diào)基因的q一value縱列(部分)2)在“數(shù)據(jù)”選項的下拉菜單中點擊“排序”選項，以q值為排序目標進行升序排序，如圖l一4:l2

12810218900_at名孟』衛(wèi)旦g口通生一0.00164一0.000381， 0193215.9099375.36968218900_a釗1206弓 218104at218104at一0.00203一0.000550_9718心 315.9099375.3699721810心at圖1一2原始差異基因中7155個下調(diào)基因(部分)選定如下條件為顯著性差異基因篩選條件:①顯著性差異值(q一value)小于0.01;②上調(diào)基因的差異倍數(shù)變化值【 foklchangevalue(Fcv)」大于2;③下調(diào)基因FCV小于0.5。以8184個上調(diào)基因文件 SAMUPresult.xls為例，篩選顯著性上調(diào)基因具體步驟如下:1)在 MicrosoftOffieeExeel2003程序中將文件 SAMUPresult.xls打開，點擊Excel表格中的H縱列(q一value列)將該列全部選定(選定后該縱列為淺藍色)，如圖l一3;圖1一3選定上調(diào)基因的q一value縱列(部分)2)在“數(shù)據(jù)”選項的下拉菜單中點擊“排序”選項，以q值為排序目標進行升序排序，如圖l一4:l2

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 賀智晶;口腔黏膜下纖維性變病例蛋白質(zhì)組學研究[D];中南大學;2012年

相關碩士學位論文 前1條

1 趙志立;腫瘤相關巨噬細胞在口腔黏膜下纖維性變癌變中的定量研究[D];中南大學;2012年

本文編號：2814692