背景 牙齒的發(fā)育是一個(gè)牙源性上皮與間充質(zhì)相互誘導(dǎo)、相互作用的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在牙源性上皮的誘導(dǎo)下,牙源性間充質(zhì)進(jìn)一步分化形成牙本質(zhì)和牙髓,而牙源性上皮也在牙源性間充質(zhì)的誘導(dǎo)下發(fā)育形成成釉器。所以,牙源性上皮在牙齒的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育成熟中發(fā)揮著重要的作用。 目前應(yīng)用于組織工程的干細(xì)胞主要有兩種即胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。但由于胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用受倫理學(xué)方面影響,所以組織工程種子細(xì)胞只能從成體干細(xì)胞方面考慮。脂肪來(lái)源的干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種,具有所有干細(xì)胞的特性,體外培養(yǎng)有多項(xiàng)分化的能力,可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞。與其它成體干細(xì)胞相比脂肪來(lái)源的干細(xì)胞具有取材容易,獲得率高,對(duì)組織損傷小等特點(diǎn),故在組織工程中有著重要的位置,是一種良好的種子細(xì)胞。 目的 本研究旨在通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討大鼠切牙Apical bud上皮細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠脂肪來(lái)源的干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力。 方法 1.大鼠Apical bud上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 取出生后4 d大鼠仔鼠切牙的Apical bud組織,采用酶消化法和差別消化法原代培養(yǎng)獲得大鼠切牙的Apical bud上皮細(xì)胞,并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CK14、抗釉原蛋白、抗波形絲蛋白。 2.大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞的培養(yǎng)及多向分化能力探討 取出生后4 d的大鼠腹股溝處的脂肪組織,酶消化法原代培養(yǎng)獲得脂肪來(lái)源的干細(xì)胞。油紅O染色鑒定成脂誘導(dǎo);茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo);神經(jīng)細(xì)胞分子標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定成神經(jīng)誘導(dǎo)。 3.大鼠切牙Apical bud上皮誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)成牙本質(zhì)樣分化實(shí)驗(yàn) 3.1體外實(shí)驗(yàn):生長(zhǎng)良好的第三代大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞,培養(yǎng)于Apical bud上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)變化。誘導(dǎo)7 d后,采用免疫組化法檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)的表達(dá)。 3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取生長(zhǎng)良好的第三代脂肪來(lái)源的干細(xì)胞,加入5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,制成細(xì)胞懸液,將分離好的Apical bud上皮放入懸液中,離心獲得重組細(xì)胞團(tuán),加入20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃,5% CO2飽和濕度條件下過(guò)夜培養(yǎng)。次日將重組細(xì)胞團(tuán)植入大鼠腎被膜下。8周后腎被膜下取材,分別采用HE染色、Masson三色法和免疫組化方法對(duì)移植生成物進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果 1.大鼠Apical bud上皮細(xì)胞:酶消化法獲得的原代上皮細(xì)胞為混雜細(xì)胞,呈長(zhǎng)梭狀的細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞,呈多角形的是上皮樣細(xì)胞,上皮樣細(xì)胞被成纖維樣細(xì)胞包繞,呈“島”樣分布。經(jīng)過(guò)2至3次差別消化,成纖維樣的細(xì)胞被完全去除,貼壁細(xì)胞全部為上皮樣細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)CK14表達(dá)陽(yáng)性;釉原蛋白表達(dá)陽(yáng)性;抗波形絲蛋白表達(dá)陰性。 2.大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞:原代細(xì)胞呈小多角形或短梭形,單核,有時(shí)突起較多,并存在一些多脂滴細(xì)胞,經(jīng)傳代后多脂滴細(xì)胞減少,脂肪干細(xì)胞突起減少,呈小多角形或短梭形,生長(zhǎng)較快,在傳代過(guò)程中未見形成自發(fā)鈣結(jié)節(jié),也未見到向成熟脂肪細(xì)胞。成脂誘導(dǎo)后,油紅O染色可見成紅色的脂滴顆粒,證實(shí)ADSCs成脂分化。成骨誘導(dǎo)中,茜素紅染色可見呈橘紅色鈣鹽沉積,證實(shí)ADSCs成骨分化。脂肪來(lái)源的干細(xì)胞向成神經(jīng)方向誘導(dǎo)的過(guò)程中,神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100蛋白染色均為陽(yáng)性結(jié)果,證實(shí)ADSCs成神經(jīng)分化。 3.體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果: Apical bud上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可誘導(dǎo)脂肪來(lái)源干細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,均可見細(xì)胞變長(zhǎng),并出現(xiàn)極性改變,細(xì)胞呈平行排列的趨勢(shì)。免疫組化均可見DSPP呈陽(yáng)性染色。RT-PCR檢測(cè)顯示DSPP和DMP-1表達(dá)。 4.體內(nèi)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Apical bud上皮細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞重組體腎被膜下生成物的HE染色可見管樣牙本質(zhì)和骨樣牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu);Masson三色法可以觀察到有綠色的牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu);免疫組化檢測(cè)中CK14染色陽(yáng)性,DSPP染色陽(yáng)性。 結(jié)論 1.采用酶消化法和差別消化法能夠原代培養(yǎng)獲得大鼠切牙的Apical bud上皮細(xì)胞; 2.采用酶消化法能夠原代培養(yǎng)獲得大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞,并證實(shí)其具有多向分化能力; 3. Apical bud上皮細(xì)胞在體外能夠誘導(dǎo)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化; 4. Apical bud上皮與脂肪來(lái)源的干細(xì)胞重組在體內(nèi)可以構(gòu)建出牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

31圖1.1 大鼠切牙Apicalbud 上皮細(xì)胞形態(tài)(×40) 圖1.2.3 上皮細(xì)胞抗波形絲蛋白陰性(免疫組化×200)圖 1.2.1 上皮樣細(xì)胞抗 CK-14 染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細(xì)胞抗釉原蛋白染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 2

31圖1.1 大鼠切牙Apicalbud 上皮細(xì)胞形態(tài)(×40) 圖1.2.3 上皮細(xì)胞抗波形絲蛋白陰性(免疫組化×200)圖 1.2.1 上皮樣細(xì)胞抗 CK-14 染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細(xì)胞抗釉原蛋白染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 2.1 脂肪來(lái)源的干細(xì)胞形態(tài)(×40) 圖 2

圖 1.2.1 上皮樣細(xì)胞抗 CK-14 染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 1.2.2 上皮細(xì)胞抗釉原蛋白染色陽(yáng)性(免疫組化×400)圖 2.1 脂肪來(lái)源的干細(xì)胞形態(tài)(×40) 圖 2.3 脂肪來(lái)源的干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后油紅 O 染色(×200)

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本文編號(hào)：2814368