舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔最常見的惡性腫瘤,目前主要采取手術(shù)、化療和放療結(jié)合的綜合治療措施,仍存在不易根治的問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和人類基因組計(jì)劃的不斷發(fā)展,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展被認(rèn)為是在內(nèi)外因素作用下,癌基因和抑癌基因失調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖的過程。針對(duì)癌基因或抑癌基因的基因治療有望成為常規(guī)治療的補(bǔ)充,用于消滅復(fù)發(fā)或殘存的腫瘤細(xì)胞,在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用研究中取得了令人矚目的成果。其中,以封閉和抑制特定基因表達(dá)為目的的反義寡核苷酸技術(shù)在腫瘤治療方面顯示了廣闊的發(fā)展前景。 反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)技術(shù),是近十幾年興起的一種生物高新技術(shù),是指利用人工合成的反義RNA和DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制,特異性封閉有害基因,防止或阻斷疾病相關(guān)蛋白的表達(dá),以達(dá)到治療某一疾病的目的。反義寡核苷酸還可以干擾mRNA的代謝,包括5’加帽、剪接、翻譯起始及延長等。國內(nèi)外學(xué)者利用反義寡核苷酸技術(shù)加快了癌細(xì)胞凋亡,己從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)臨床并取得一定成效。20世紀(jì)90年代以來,反義寡核苷酸技術(shù)用來治療肝癌、卵巢癌等若干人類腫瘤已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn),未見明顯副作用。反義寡核苷酸技術(shù)被認(rèn)為是最有希望運(yùn)用于臨床的基因治療手段。目前,尋找良好的靶點(diǎn)仍是反義寡核苷酸技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和難題。 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 近年來大量研究發(fā)現(xiàn)端粒酶是人體內(nèi)最具腫瘤特異性和高表達(dá)的生物學(xué)標(biāo)志,85%以 上的惡性腫瘤有端粒酶活性,而正常體細(xì)胞幾乎未見其表達(dá)。它是由端粒酶RNA、端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶(human telornerase reverse transeriptase,hTERT)基因和端粒酶相關(guān)蛋白構(gòu)成的復(fù) 合體,以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)序列(T TAGGG)n,維持端粒長度。深入研 究發(fā)現(xiàn),hTERT與端粒酶活性平行,并決定端粒酶活性,是端粒酶激活的限速步驟。90% 以上惡性腫瘤有hTE盯轉(zhuǎn)錄,hTE盯比端粒酶RNA與惡性腫瘤更具相關(guān)性。用反義hTERT 導(dǎo)入肝癌細(xì)胞,白血病細(xì)胞等癌細(xì)胞后具有明顯抑制生長及誘導(dǎo)凋亡作用;將高表達(dá)hTERT 癌細(xì)胞敲除hTERT mRNA后,細(xì)胞惡性表型出現(xiàn)逆轉(zhuǎn);正常細(xì)胞導(dǎo)入hTE盯后,細(xì)胞永 生化,經(jīng)分裂數(shù)代后出現(xiàn)惡性生物學(xué)行為。這些證據(jù)表明,hTERT與癌的發(fā)生發(fā)展密切相 關(guān),hTE盯己成為抗癌治療的靶點(diǎn)。而國內(nèi)外文獻(xiàn),尚未見有以hTE盯為靶點(diǎn)抑制舌鱗癌 的系統(tǒng)報(bào)道。 本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)口腔鱗癌組織中hTERTmRNA的表達(dá)情況,探討 hTERT在口腔中表達(dá)的意義。以端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因作為分子靶點(diǎn),設(shè)計(jì)一段與之互補(bǔ)的 反義寡核普酸序列,采用具有轉(zhuǎn)染率高、毒性低的陽離子脂質(zhì)體作介導(dǎo),將hTERT反義寡 核普酸導(dǎo)入口腔鱗癌Tcas 113細(xì)胞,探討其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和端粒酶活性的 影響及機(jī)理。將經(jīng)過hTERT反義寡核昔酸預(yù)處理的rcasll3細(xì)胞接種于裸鼠,觀察Tcasll3 細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤時(shí)間、瘤重和端粒酶變化,了解hTERT反義寡核普酸在體內(nèi)環(huán)境下對(duì) Tcas 113細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過上述系統(tǒng)研究,探討以hTE盯為靶點(diǎn)開展抗舌癌研 究的可行性,為深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 研究對(duì)象:新鮮口腔鱗癌及其手術(shù)切緣組織、正�？谇徊�、人舌鱗狀細(xì)胞癌Tcasll3 細(xì)胞株和BALB/C裸鼠 2研究方法: 采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)新鮮口腔鱗癌及其手術(shù)切緣組織、正常口腔勃膜和Tcas 113 細(xì)胞中hTERTmRNA的表達(dá)情況。 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 2.2采用脂質(zhì)體包裹法將反義寡核昔酸序列導(dǎo)入Tca81I3細(xì)胞,寡核昔酸終濃度為0.5林M、 1.郎M和2.0林M,同時(shí)設(shè)正義寡核昔酸、空載體和空白培養(yǎng)基為對(duì)照。 2.3倒置顯微鏡下觀察Tcasll3細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,流 式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,ONA瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)Tcas!13細(xì)胞的ONA!adder, TRAP一ELISA法和TRAP銀染法檢測(cè)細(xì)胞和移植瘤組織端粒酶活性,RT-PCR法分析 eyelinol、Bel一2和e一Mye mRNA的表達(dá)。采用Western blot檢測(cè)Tcasll3細(xì)胞中hTE盯蛋 白表達(dá)量。HE染色法觀察裸鼠移植瘤組織病理學(xué)表現(xiàn),免疫組化法檢測(cè)瘤體組織中細(xì)胞增 殖核抗原(proliferating eell nuelear antigen,PeNA)和Be一2的表達(dá),裸鼠移植瘤組織中 hTE盯表達(dá)采用R下pCR方法檢測(cè)。 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 采用sPSsl 1 .0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異比較采用 t檢驗(yàn)、ANOVA和Sludent一Ne、man一Keuls檢驗(yàn),尸005認(rèn)為差異具有顯著性意義。 結(jié)果 1口腔鱗癌組織中hTERT mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量法結(jié)果顯示:口腔鱗癌組hTE階’值(Mean士50)為34 1 9.97士2653.24 (拷貝數(shù)/2林L),明顯高于口腔鱗癌切緣組織(297.50士3!2.40)和正常勃膜組(!31 .63士 258.33),尸0.05。鱗癌切緣組織和正常組織間hTERT mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 10%(10/30)口腔鱗癌組織、77.8%(23/30)鱗癌切緣組織和90%(9/10)正�？谇汇@膜 hTERTmRNACt值35。不同分化程度口腔鱗癌組織hTERT mRNA的表達(dá)情況與臨床病理 學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)(P0.05),但顯示出升高的趨勢(shì)。說明hTERT在口腔鱗癌組織中特異 性高表達(dá)。 2反義寡核普酸對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響 0.25林M一1.鄰M反義寡核普酸組Tcasll3細(xì)胞能夠緩慢增殖,但48h后,反義寡核營酸 組細(xì)胞增?
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2005
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文DN^一adder瓊脂褚凝膠電泳分析從圖3可見，2h4時(shí)，各組細(xì)胞的ONAldader(“梯狀”條帶)不明顯。反義寡核2.0則在4h8時(shí)即檢測(cè)到清晰的細(xì)胞凋亡特征性的ONA!dader，7h2時(shí)，.05卜M、L2.0州反義寡核昔酸均可檢測(cè)到該梯狀條帶。正義寡核昔酸組、空載體組各濃度組培養(yǎng)基組間在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到ONAldader，只在加樣孔附近出現(xiàn)明亮的大分條帶，見圖3，o4M123123M123

sli3細(xì)胞nNA一adder瓊脂箱凝markerl，ASODN2.0林MZ，SODN3，空載體組.20料M4，培養(yǎng)基組側(cè)細(xì)胞凋亡率變化義寡核普酸轉(zhuǎn)染Tcas113細(xì)胞培雙染色法檢測(cè)到細(xì)胞早期凋亡率增度和培養(yǎng)時(shí)間的增加而增高。正義率略增高，但與空白培養(yǎng)基組無差雙染色法槍側(cè)細(xì)胞凋亡率(%)變化(濃度(林.051.0組11.79士1.42*l〔3.41土組5.75土0.387.15土1.

圖10.R-TpeR法槍側(cè)AsoDN(卜M)組Tcasll3細(xì)胞Bel一ZmRNA的表達(dá)ASODNASODNASODN0.5pM1.0pM2.0pM

本文編號(hào)：2811821