背景和目的 牙周病治療的最終目標(biāo)是在控制牙周炎癥的基礎(chǔ)上完成牙周組織的重建。牙周再生一直是牙周領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),目前應(yīng)用于牙周再生的方法主要有：引導(dǎo)組織再生術(shù)(guided tissue regeneration, GTR)、骨材料移植、生長因子的應(yīng)用以及近年來研究較多的組織工程技術(shù)。然而這些手段都不能實(shí)現(xiàn)牙周組織的完全再生,僅能不同程度地重建部分牙周附著,其中牙骨質(zhì)的再生顯得尤為困難,目前仍不能預(yù)測牙骨質(zhì)再生的數(shù)量和質(zhì)量。 牙骨質(zhì)是圍繞在牙根周圍的一薄層礦化結(jié)締組織,是牙周組織的重要組成部分。牙骨質(zhì)的最主要生理功能是為牙周膜纖維提供附著的錨點(diǎn)。牙骨質(zhì)中羥基磷灰石占50%,牙骨質(zhì)基質(zhì)占50%。由膠原蛋白和非膠原蛋白構(gòu)成。近些年的研究發(fā)現(xiàn)牙骨質(zhì)基質(zhì)中含有多種非膠原蛋白和生長因子,如骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)、骨橋素(osteopontin, OPN)、纖連蛋白(fibronectin, FN)、骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein, BMP-2,-3,-4)、血小板來源生長因子-α,β (platelet-derived growth factor-a and β, PDGF-a and β)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF-β)等,其獨(dú)特的細(xì)胞外基質(zhì)成分可能為牙骨質(zhì)的再生提供一個良好的微環(huán)境。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)EDTA處理的人健康的牙骨質(zhì)根片能夠誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)牙骨質(zhì)新生。然而,這一結(jié)論是否同樣適用于牙周炎累及的病變牙骨質(zhì)呢?如果不能,是否有一些生長因子能夠增強(qiáng)其促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的作用呢? 當(dāng)牙周炎癥破壞牙齦膠原纖維到達(dá)牙根表面時(shí),牙骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分就遭到了破壞,稱為病變牙骨質(zhì)。雖然有研究發(fā)現(xiàn)病變牙骨質(zhì)在去除牙石菌斑基礎(chǔ)上經(jīng)過簡單拋光也能達(dá)到牙周健康,但近幾年一些學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)病變牙骨質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的一些非膠原蛋白成分發(fā)生了改變,如骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)、纖粘連蛋白(FN)等。這些成分的改變勢必影響了牙骨質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境,這種病變牙骨質(zhì)是否仍有利于牙骨質(zhì)再生,目前鮮有報(bào)道。 在眾多應(yīng)用于牙周再生的生長因子中,釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)被公認(rèn)具有促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的作用。EMPs是一組以釉原蛋白為優(yōu)勢的蛋白,它并不是單一的生長因子,它的存在可能一定程度上模仿了牙骨質(zhì)發(fā)育時(shí)期的情況。釉基質(zhì)衍生物(enamel matrix derivative, EMD)是經(jīng)過純化的釉基質(zhì)蛋白,其主要成分為釉原蛋白(amelogenin),商品名為Emdogain,廣泛應(yīng)用于臨床和動物實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EMD能夠誘導(dǎo)形成無細(xì)胞外源纖維性牙骨質(zhì)。臨床對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EMD比應(yīng)用屏障膜能夠獲得更多的臨床附著。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)EMD在體外能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞的生物學(xué)性能產(chǎn)生影響,并能誘導(dǎo)多種細(xì)胞,如牙周膜細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等向成骨／成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化。但目前EMD在牙骨質(zhì)表面和牙本質(zhì)表面上的作用是否不同尚未見報(bào)道。 因此,本研究的目的在于觀察原位保留的牙周炎病變牙骨質(zhì)是否能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)再生,在保留牙骨質(zhì)的基礎(chǔ)上加入EMD是否能強(qiáng)化牙骨質(zhì)再生的效果。 方法 1.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化的研究 1.1病變牙骨質(zhì)原位保留對人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化影響的體外研究 收集因牙周炎Ⅲ度松動而拔除的前牙和前磨牙48顆,并沿牙齦邊緣和牙周袋底做標(biāo)記。沿標(biāo)記截取中間部分,EMS超聲器械去除根面牙石菌斑后縱裂為對稱的兩片,一片用刮治器去除根面牙骨質(zhì),暴露根面牙本質(zhì)(dentin, D組),另一片保留牙骨質(zhì)(cementum, C組)。所有根片經(jīng)24%EDTA凝膠酸蝕2min后于20萬U／ml青霉素鏈霉素溶液4℃浸泡48h,無菌PBS沖洗后備用。收集因正畸需要拔除的前磨牙的牙周膜,組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,胰酶消化,收集第二代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。C組和D組各取24片置于48孔板內(nèi),第二代牙周膜細(xì)胞以1×106／ml的濃度接種到根片表面,共培養(yǎng)7天后,每組取四片進(jìn)行掃描電鏡觀察,每組剩余20片分別用微量RNA提取試劑盒提取總RNA,熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測兩組牙骨質(zhì)附著蛋白(cementum attachment protein,CAP)和牙骨質(zhì)蛋白-23(cementum protein-23,CP-23)的mRNA表達(dá)量。 1.2原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對人牙周膜細(xì)胞體內(nèi)形成牙骨質(zhì)的影響 牙本質(zhì)組和牙骨質(zhì)組根片各取24片置于48孔板內(nèi),第二代牙周膜細(xì)胞以1x106個/ml的濃度接種到根片表面,按照重懸液的不同,將兩組根片分為四組：牙骨質(zhì)片滴加DMEM培養(yǎng)液為C組,牙骨質(zhì)片滴加EMD培養(yǎng)液為E+C組,牙本質(zhì)片滴加DMEM培養(yǎng)液為D組,牙本質(zhì)片滴加EMD培養(yǎng)液為E+D組。每三天換液一次,共培養(yǎng)至第七天時(shí),用聚四氟乙烯膜包裹根片,植入裸鼠背部皮下,每只裸鼠共植入四片,每組一片。三周后處死裸鼠取出根片,10%EDTA液脫鈣后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、5μm切片、HE染色,觀察四組標(biāo)本新生組織的形成情況,對有牙骨質(zhì)類似物形成的標(biāo)本進(jìn)行BSP的免疫組化染色觀察。 2.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD在Ⅲ度根分叉病變牙骨質(zhì)再生及新附著形成中的作用 選取雄性比格犬八只,雙側(cè)下頜第三第四前磨牙(P3P4)作為實(shí)驗(yàn)牙位。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日前四周,在實(shí)驗(yàn)牙位制作高度為5mm的Ⅲ度根分叉骨缺損并置入含有牙周混合菌的棉球2周,以建立Ⅲ度根分叉病變模型。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日前2周將棉球取出,并對實(shí)驗(yàn)牙位進(jìn)行齦下刮治以去除菌斑牙石。此后每天用氯己定溶液進(jìn)行口腔衛(wèi)生護(hù)理。手術(shù)當(dāng)天,未見明顯炎癥和牙齦退縮,每只比格犬的雙側(cè)P3P4按隨機(jī)原則接受下列處理方法中的一種：C：保留病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min；D：刮除病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min；E+C：保留病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min+EMD凝膠；E+D：刮除病變牙骨質(zhì)+EDTA酸蝕2min+EMD凝膠。各組均在全麻下頰側(cè)翻瓣,刮除肉芽組織,并按實(shí)驗(yàn)要求處理相關(guān)根面,并于根分叉入口覆蓋海奧膠原膜。基于本實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)操作方便的考慮,操作過程中未給以舌側(cè)翻瓣。術(shù)后八周4%多聚甲醛灌注法處死動物,取出標(biāo)本,每組共獲8個標(biāo)本,每組取2個標(biāo)本進(jìn)行硬組織包埋處理,切片,甲苯胺藍(lán)染色,進(jìn)行組織學(xué)觀察。每組剩余6個標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫鈣,石蠟包埋,5μm切片,HE染色,進(jìn)行新生組織的觀察和測量。 結(jié)果 1.根面保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化的研究 1.1病變牙骨質(zhì)原位保留對人牙周膜細(xì)胞成牙骨質(zhì)分化影響的體外研究 牙周膜組織塊貼壁7-10天左右,倒置顯微鏡下可見單個細(xì)胞從組織塊周邊游出,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)瓶底80%時(shí)可進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞經(jīng)免疫染色顯示波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,證明培養(yǎng)的細(xì)胞是中胚層來源的間充質(zhì)細(xì)胞且無外胚層來源的細(xì)胞污染。第二代牙周膜細(xì)胞接種于兩組根片后的掃描電鏡顯示：兩組根片上細(xì)胞生長良好,牙本質(zhì)片上細(xì)胞呈長梭形,牙骨質(zhì)片上細(xì)胞略大,長梭形態(tài)不明顯。熒光實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示：牙骨質(zhì)組(C組)CAP mRNA表達(dá)量顯著高于牙本質(zhì)組(D組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；C組CP-23mRNA表達(dá)量顯著高于D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。 1.2原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD對人牙周膜細(xì)胞體內(nèi)形成牙骨質(zhì)的影響 裸鼠植入根片后,活動良好,未出現(xiàn)飲食異常。術(shù)后一周拆線,除一只裸鼠的左上傷口縫線已開,根片脫離外,其余傷口均愈合良好。聚四氟乙烯膜包繞根片位于裸鼠皮下,無感染,無暴露。三周時(shí)取材,D、E+C、E+D三組均獲得12個標(biāo)本,C組獲得11個標(biāo)本。HE染色結(jié)果顯示：D組與E+D組均無牙骨質(zhì)類似物形成,新生物均為疏松的纖維結(jié)締組織；C組有7個標(biāo)本表現(xiàn)為新生牙骨質(zhì)類似物形成,E+C組有10個標(biāo)本表現(xiàn)為新生牙骨質(zhì)類似物形成,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。BSP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的新生牙骨質(zhì)類似物均對BSP染色陽性。 3.原位保留病變牙骨質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用EMD在Ⅲ度根分叉病變牙骨質(zhì)再生及新附著形成中的作用 我們成功建立了32顆比格犬下頜前磨牙的Ⅲ度根分叉病變模型。術(shù)后八周,所有牙位愈合良好,無明顯感染或牙齦退縮。組織學(xué)測量結(jié)果顯示,新生牙骨質(zhì)百分比：C組顯著高于D組,而E+C組和E+D組顯著高于C組,E+C組和E+D組組間差異不顯著。新生骨百分比：C組顯著高于D組,而E+C組和E+D組顯著高于C組,E+C組和E+D組組間差異不顯著。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),D組新生牙周膜纖維稀疏,無主纖維束,與新生牙骨質(zhì)和牙槽骨平行排列或排列混亂,未插入其中形成良好的新附著；C組新生牙骨質(zhì)沉積在原有牙骨質(zhì)表面,牙周膜纖維排列整齊,且有主纖維束分別插入新生牙槽骨和牙骨質(zhì)中,形成新附著；E+D組與E+C組新生牙骨質(zhì)數(shù)量多,牙周膜纖維粗大,大多建立了良好的新附著,但E+D組多見新生牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)表面存在裂隙,新生牙周膜纖維排列雜亂。硬組織切片觀察結(jié)果與石蠟切片結(jié)果相似,但未見明顯的新生牙骨質(zhì)與根面分離的情況。 結(jié)論 1.經(jīng)EDTA處理的病變牙骨質(zhì)能誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞,從而促進(jìn)新生牙骨質(zhì)的生成,EMD的存在能夠增強(qiáng)這一誘導(dǎo)作用。 2.原位保留病變牙骨質(zhì)有利于牙骨質(zhì)的再生和新附著的建立,加入EMD能夠強(qiáng)化這一效果。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 Khalid Al-Hezaimi;Mansour Al-Askar;Abdulaziz Al-Rasheed;;Characteristics of newly-formed cementum following emdogain application[J];International Journal of Oral Science;2011年01期

2 陳珊;楊軍英;張盛炎;馮磊;;建立小型豬Ⅱ度根分叉缺損模型的可行性[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年33期

3 賈惠梅;歐陽翔英;曹采方;;釉基質(zhì)蛋白對牙周膜細(xì)胞在牙骨質(zhì)根面上生長的影響[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年02期

本文編號：2811791