【摘要】：研究目的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(Gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是一種易于獲取、體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)以及具有多向分化能力的干細(xì)胞,可通過(guò)各種免疫調(diào)節(jié)特性發(fā)揮生物治療作用。巨噬細(xì)胞(Macrophages,Mφ)是炎癥修復(fù)中的免疫明星細(xì)胞,在抗炎和組織修復(fù)過(guò)程中起重要作用。根據(jù)不同微環(huán)境信號(hào),巨噬細(xì)胞可以分化成兩種類(lèi)型,即促炎性M1巨噬細(xì)胞(M1 Mφ)和抗炎性M2巨噬細(xì)胞(M2 Mφ)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)比較不同來(lái)源的人巨噬細(xì)胞生物學(xué)特征,選擇最合適的巨噬細(xì)胞極化方案,研究了GMSCs對(duì)氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導(dǎo)的人炎性巨噬細(xì)胞極化的影響,希望為GMSCs治療高脂血癥牙周病的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和新思路。實(shí)驗(yàn)方法1、利用密度梯度離心法和磁珠分離法從人靜脈血中獲得高純度的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的誘導(dǎo)下獲得PBMC Mφ;用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-1分化形成THP-1 Mφ;兩組Mφ再分別向M1和M2兩種極化類(lèi)型誘導(dǎo)分化。在高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和粘附情況;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)M1和M2型相關(guān)極化標(biāo)記表達(dá);通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量培養(yǎng)上清液的細(xì)胞因子分泌水平變化。2、收集因阻生齒或正畸治療而拔牙過(guò)程中廢棄的健康牙齦結(jié)締組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)獲得GMSCs;經(jīng)過(guò)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、成骨/成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析牙齦細(xì)胞的干細(xì)胞特征;通過(guò)Transwell小室建立M1 Mφ和GMSCs非接觸式共培養(yǎng)模型,并用ox-LDL刺激24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),通過(guò)ELISA檢測(cè)收集上清液的細(xì)胞因子分泌變化,用流式細(xì)胞術(shù)和PCR分析巨噬細(xì)胞中M1和M2相關(guān)極化標(biāo)記表達(dá),通過(guò)油紅O染色并定量分析細(xì)胞內(nèi)脂滴變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、兩組懸浮細(xì)胞牢固粘附后,觀察到典型的Mφ形態(tài);PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,兩種Mφ均在M1極化因子(LPS/IFN-γ)誘導(dǎo)后,TNF-α和IL-1β的mRNA水平顯著上調(diào)(P0.05),CD86的表達(dá)明顯增加(P0.05)。在M2極化因子(IL-4)誘導(dǎo)后,MRC1和IL-10 mRNA水平上調(diào)(P0.05);CD206在PBMC Mφ中表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05),而在THP-1 Mφ中沒(méi)有差異(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,在M1極化誘導(dǎo)后,THP-1 Mφ的培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α分泌水平比PBMC Mφ更高(P0.05)。2、通過(guò)酶消化法可以有效獲取GMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P4代細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)GMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD73、CD90和CD105,而幾乎不表達(dá)CD45;集落形成分析表明細(xì)胞更新和增殖能力強(qiáng);GMSCs可以在特定誘導(dǎo)條件下分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞,提示具有多向分化潛能;GMSCs與ox-LDL誘導(dǎo)下的M1 Mφ共培養(yǎng)后,Mφ的偽足明顯減少,形態(tài)變圓鈍;PCR結(jié)果顯示GMSCs顯著降低M1 Mφ中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因水平(P0.05),并且增加了MRC1和IL-10的基因水平(P0.05)。上清液中細(xì)胞因子的分泌水平不同,共培養(yǎng)組中TNF-α顯著降低(P0.05),而IL-6、IL-1β相對(duì)增加(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析表明,GMSCs顯著降低細(xì)胞表面CD86和HLA-DR的表達(dá)(P0.05)。油紅O染色顯示共培養(yǎng)組Mφ中積聚的脂滴較少(P0.05)。結(jié)論THP-1 Mφ與PBMC Mφ有相似的極化表達(dá),THP-1更適合M1極化而非M2極化的研究;通過(guò)酶消化法從牙齦組織中分離的GMSCs被鑒定具有干細(xì)胞特征;GMSCs通過(guò)旁分泌作用抑制ox-LDL刺激后M1巨噬細(xì)胞的活化及誘導(dǎo)M2表型,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),并且影響巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R781.42

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本文編號(hào)：2805681