發(fā)布時間：2020-08-26 17:23

【摘要】：大約70%的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者其病因與關(guān)節(jié)盤移位有關(guān),通常會伴有關(guān)節(jié)疼痛和組織退行性變。嚴重顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者往往伴有骨關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)盤穿孔,需要通過手術(shù)來治療,方法包括關(guān)節(jié)盤的修補/摘除,以及全關(guān)節(jié)置換等。 相比手術(shù)治療,使用組織工程技術(shù)在體內(nèi)治療關(guān)節(jié)盤病變導(dǎo)致的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病顯得更有潛力。顳下頜關(guān)節(jié)盤是一種特殊的纖維軟骨,與透明軟骨或膝關(guān)節(jié)半月板有很大區(qū)別,因此不能照搬這兩種軟骨的組織工程研究模式。目前報道的顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程研究大多數(shù)都使用關(guān)節(jié)盤本體細胞作為種子細胞。體外研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)盤來源的纖維軟骨細胞在培養(yǎng)過程中會發(fā)生去分化現(xiàn)象,表現(xiàn)為細胞合成軟骨基質(zhì)能力下降以及相關(guān)基因表達下降,例如Ⅱ型膠原和軟骨低聚基質(zhì)蛋白(COMP)。此外使用軟骨/纖維軟骨來源的細胞會造成供體組織的損傷。 滑膜來源的間充質(zhì)干細胞(SDSCs)可以作為種子細胞用于軟骨組織工程研究。和軟骨細胞一樣,SDSCs能夠合成軟骨低聚基質(zhì)蛋白、連接蛋白,以及糖胺聚糖(GAG)。相比骨髓基質(zhì)間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs),SDSCs具有更強的成軟骨能力和體外擴增能力,因而在軟骨組織工程研究中得到越來越多的重視。 顳下頜關(guān)節(jié)滑膜中也可分離培養(yǎng)SDSCs。研究證實,顳下頜關(guān)節(jié)來源的SDSCs同樣具有多向分化能力。本研究將使用顳下頜關(guān)節(jié)來源的SDSCs用于關(guān)節(jié)盤組織再生的研究。 纖維蛋白凝膠是經(jīng)美國食品及藥物管理局(FDA)批準的一種可生物降解材料,在臨床上廣泛應(yīng)用于傷口愈合。在軟骨組織工程領(lǐng)域,纖維蛋白凝膠作為支架材料可促進軟骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成。纖維蛋白凝膠的主要缺點是生物力學(xué)性能較弱、在體外/體內(nèi)都具有較快的降解速率,因此不適合單獨作為支架材料使用。本研究嘗試將纖維蛋白凝膠同海綿狀的殼聚糖支架相結(jié)合,希望利用纖維蛋白凝膠的特性提高種子細胞在支架上的接種效率、細胞分布,以及細胞外基質(zhì)的合成,檢測這種復(fù)合支架用于組織工程研究的可能。 為了評估本實驗所構(gòu)建的SDSCs/支架復(fù)合物在體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)盤穿孔的能力,需要制備關(guān)節(jié)盤穿孔模型。由于直接在動物體內(nèi)做關(guān)節(jié)盤穿孔并植入細胞復(fù)合物的研究要求較高,難以大規(guī)模開展,目前報道的顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程的研究大多數(shù)處于體外研究階段。本研究使用顳下頜關(guān)節(jié)盤外植體的形式研究關(guān)節(jié)盤組織工程。本研究通過在大鼠關(guān)節(jié)盤外植體上制備關(guān)節(jié)盤穿孔模型,將這種細胞支架復(fù)合物植入關(guān)節(jié)盤缺損處,最后將關(guān)節(jié)盤外植體植入裸鼠皮下,以觀察其修復(fù)能力。關(guān)節(jié)腔滑液為血清滲出物,其主要有效成分和血清類似。因此將關(guān)節(jié)盤游離出來,以器官培養(yǎng)方式在皮下培養(yǎng),能夠在一定程度上模擬關(guān)節(jié)腔內(nèi)的環(huán)境。 關(guān)節(jié)盤外植體植入2-4周后,對其進行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測,了解有無纖維軟骨樣細胞外基質(zhì)的形成以及材料和穿孔邊緣整合的情況,以評估顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞復(fù)合纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架修復(fù)關(guān)節(jié)盤穿孔的能力。 第一部分大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及多向分化潛能的實驗研究 [目的]探討大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和多向分化能力,為關(guān)節(jié)盤組織工程提供種子細胞。 [材料和方法]從大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤雙板區(qū)獲取滑膜組織,采用組織塊法和連續(xù)傳代法進行培養(yǎng)和純化SDSCs,記錄細胞的形態(tài)。取生長良好的第三代SDSCs進行①成軟骨誘導(dǎo)分化,Ⅱ型膠原免疫組化檢測；②成骨誘導(dǎo)分化,茜素紅染色檢測：③成脂肪誘導(dǎo)分化,油紅O染色檢測。 [結(jié)果]①利用組織塊法和連續(xù)傳代法培養(yǎng)和純化的SDSCs,細胞呈短梭狀,形態(tài)均勻一致；②成軟骨誘導(dǎo)分化細胞表達Ⅱ型膠原；③成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色可見鈣化結(jié)節(jié)；④成脂肪誘導(dǎo)分化油紅O染色陽性。 [結(jié)論]從大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜中能分離出SDSCs,這些細胞具有多向分化能力,可作為軟骨組織工程的種子細胞。 第二部分纖維蛋白凝膠復(fù)合殼聚糖支架的制備及相關(guān)性能檢測 [目的]探討纖維蛋白凝膠復(fù)合殼聚糖支架的制備方法,為關(guān)節(jié)盤組織工程提供支架材料。 [材料和方法]將等量纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液混合,待纖維蛋白原聚合后形成凝膠。在冷凍干燥法制備的海綿狀殼聚糖支架上滴加纖維蛋白原溶液,加入等量凝血酶溶液,聚合后即成纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架,用掃面電鏡檢查材料表面性狀。 [結(jié)果]冷凍干燥后的殼聚糖支架呈為海綿狀,充滿孔隙。等量纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液混合后,在37℃10分鐘即可形成透明、柔軟有韌性的凝膠。一塊殼聚糖支架可以結(jié)合50μL纖維蛋白原溶液和50μL凝血酶溶液,制成纖維蛋白凝膠/殼聚糖復(fù)合支架。掃面電鏡顯示纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架表面有凝膠充填于孔隙之間。 [結(jié)論]將等量的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液加入殼聚糖支架,待纖維蛋白原聚合后即可制備纖維蛋白凝膠/殼聚糖復(fù)合支架,其結(jié)構(gòu)依然為多孔海綿狀,可用于組織工程研究。 第三部分纖維蛋白凝膠/殼聚糖復(fù)合支架對顳下頜關(guān)節(jié)SDSCs三維培養(yǎng)的影響 [目的]將顳下頜關(guān)節(jié)SDSCs植入纖維蛋白凝膠/殼聚糖復(fù)合支架,體外培養(yǎng)觀察細胞在這種復(fù)合支架上生長狀況。 [材料和方法]將等量SDSCs(2×106/支架)接種至纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架(實驗組)和純殼聚糖支架(對照組)后進行體外培養(yǎng)。接種8小時后,收集未貼附支架的細胞,計算細胞貼附率。在培養(yǎng)第7天使用FDA/PI染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察支架表面以下100微米處細胞分布和數(shù)量。在培養(yǎng)的第1,7,14,21,和28天使用CCK-8試劑檢測并比較兩種細胞/支架復(fù)合物中細胞數(shù)量,評估細胞增殖情況。 [結(jié)果]實驗組(97.28%)細胞在接種8小時其貼附率顯著高于對照組(90.79%)。激光共聚焦檢測顯示在材料表面100微米以下,實驗組較對照組的細胞數(shù)量更多,分布更加均勻。細胞增殖結(jié)果顯示在三維培養(yǎng)的第1天到第7天,實驗組和對照組中細胞增殖沒有顯著性差異。從第7天到28天,實驗組細胞顯著多于對照組。 [結(jié)論]纖維蛋白凝膠能夠促進SDSCs在海綿狀殼聚糖支架中的接種效率、細胞分布和增殖。 第四部分顳下頜關(guān)節(jié)SDSCs在纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架中軟骨分化能力的體外實驗 [目的]對SDSCs接種的纖維蛋白凝膠/殼聚糖復(fù)合物進行體外軟骨化誘導(dǎo),檢測SDSCs在這種支架材料中的軟骨分化能力。 [材料和方法]將等量SDSCs(2×106/支架)接種至纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架(實驗組)和純殼聚糖支架(對照組)后進行體外軟骨化誘導(dǎo)培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡觀察兩組細胞支架復(fù)合物表面形態(tài)的改變。使用實時定量PCR法檢測細胞支架復(fù)合物誘導(dǎo)28天后細胞的軟骨相關(guān)基因(Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、SOX9)的表達。分別在誘導(dǎo)的第0,14,和28天定量計算細胞支架復(fù)合物的GAG/DNA比值,比較細胞合成GAG的能力。 [結(jié)果]體外軟骨化誘導(dǎo)28天后,倒置顯微鏡觀察可見實驗組支架表面細胞基質(zhì)團塊更多,體積更大；實驗組細胞在Ⅰ型膠原表達上顯著高于對照組,其余兩個基因表達沒有明顯差異。實驗組GAG/DNA比值在第14天和第28天均高于對照組。 [結(jié)論]纖維蛋白凝膠能增強SDSCs合成軟骨樣基質(zhì)的能力,有利于SDSCs向軟骨方向分化。 第五部分顳下頜關(guān)節(jié)SDSCs復(fù)合纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架修復(fù)關(guān)節(jié)盤穿孔模型的體內(nèi)研究 [目的]以外植體方式制備關(guān)節(jié)盤穿孔模型,將細胞/支架復(fù)合物植入穿孔中,置入體內(nèi)培養(yǎng)觀察,評估其修復(fù)關(guān)節(jié)盤穿孔的能力。 [材料和方法]制備游離大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤并做直徑2mm的標準化穿孔。制備細胞/支架復(fù)合物,將其植入穿孔內(nèi),將關(guān)節(jié)盤外植體用纖維蛋白凝膠包裹,植入裸鼠皮下。在第2周和第四周取出標本進行組織學(xué)檢測。實驗分組：SFC(SDSCs+fibrin+chitosan)組;SC(SDSCs+chitosan)組;FC(fibrin+chitosan)組；C(chitosan)組,以及F(fibrin)組。 [結(jié)果]HE染色顯示SFC組和SC組在2周和4周時支架內(nèi)都有細胞和細胞外基質(zhì)分布；SFC組比SC組有更多的細胞外基質(zhì)和更少的支架內(nèi)空腔。在FC組、C組和F組支架中有少量宿主來源的細胞,未見修復(fù)組織形成。免疫組化染色和GAG特染顯示在SFC組中Ⅰ型膠原,Ⅱ型膠原,Aggrecan,以及GAG染色均強于FC組。 [結(jié)論]SDSCs復(fù)合纖維蛋白凝膠/殼聚糖支架植入關(guān)節(jié)盤穿孔外植體模型,在體內(nèi)培養(yǎng)條件下,顯示了更強的軟骨基質(zhì)合成能力,可用于關(guān)節(jié)盤組織工程研究。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R782.6

【參考文獻】

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1 李健,龍星,朱帆,楊雪超;顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞成骨潛能的實驗研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

本文編號：2805466