大鼠脂肪干細胞（rADSCs）的分離鑒定及向成牙本質(zhì)細胞分化的實驗研究

發(fā)布時間：2020-08-25 21:45

【摘要】： 背景干細胞(stem cell)是一種具有多向分化潛能和自我復制功能的未分化細胞,在特定的條件下,可以分化為不同的功能細胞,形成多種組織和器官。按來源分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)的分化和增殖構(gòu)成個體發(fā)育的基礎(chǔ);而成體干細胞(adult stem cell, AS)的進一步分化則是成體組織、器官修復再生的基礎(chǔ),具有來源廣泛、可塑性強、無排斥反應等優(yōu)勢成為近年來研究的熱點之一。脂肪干細胞(adipose derived stem cell, ADSC)是一種成體干細胞,具有向多種細胞分化的潛能,經(jīng)過體外培養(yǎng)和體內(nèi)接種可被誘導分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞、肌肉細胞及心肌細胞等。由于脂肪干細胞具有取材容易、獲得率高、對組織損傷小等優(yōu)點,故在再生醫(yī)學中占有重要的地位,并可為組織工程提高可靠的細胞來源,為臨床應用奠定堅實的基礎(chǔ)。目的本研究通過酶消化法分離培養(yǎng)脂肪干細胞,運用牙胚細胞條件培養(yǎng)液體外誘導脂肪干細胞向成牙本質(zhì)樣細胞分化,再將脂肪干細胞與成釉器上皮細胞混合接種入體內(nèi)建立牙髓-牙本質(zhì)復合體模型,證實大鼠脂肪干細胞的成牙潛能,為牙齒組織工程化研究獲得大量、穩(wěn)定、可靠的種子細胞提供理論和實驗依據(jù);并為體內(nèi)、外成牙微環(huán)境的機理研究構(gòu)建新的模型。材料和方法 1.大鼠脂肪干細胞的培養(yǎng)、鑒定及定向誘導分化出生后4d SD仔鼠腹股溝處取得脂肪組織,酶消化法培養(yǎng)脂肪干細胞,免疫細胞化學法染色檢測Vimentin、CD29、CD44、CK,為進一步研究其分化特性奠定了基礎(chǔ)。將生長良好的ADSC培養(yǎng)于含β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的礦化液中,檢測堿性磷酸酶活性,免疫細胞化學法檢測骨鈣素和I型膠原的表達,Von Kossa染色檢測礦化結(jié)節(jié)。 2.體外誘導大鼠脂肪干細胞向成牙本質(zhì)細胞分化將生長良好的ADSC與牙胚細胞條件培養(yǎng)液進行共培養(yǎng),進行形態(tài)學觀察,免疫細胞化學法檢測牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)的表達,RT-PCR檢測牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP-1)的表達。 3.體內(nèi)誘導大鼠脂肪干細胞構(gòu)建組織工程牙本質(zhì)-牙髓復合體將標記后的ADSC分別與成釉器上皮細胞和聚醚酯彈性體(PTSG)材料混和后接種至大鼠腎被膜下,12周取材,進行組織學觀察和免疫細胞化學檢測。結(jié)果 1.脂肪干細胞鏡下形態(tài)為成纖維樣,細胞群體倍增時間為42.2h,免疫細胞化學方法檢測,抗Vimentin、CD29、CD44染色陽性,抗CK染色陰性,成骨誘導后細胞由成纖維樣變?yōu)閳A形或立方形外形,堿性磷酸酶升高,免疫細胞化學檢測骨鈣素和I型膠原表達陽性,出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié),表明ADSC已向成骨細胞轉(zhuǎn)化。 2.牙胚細胞條件培養(yǎng)液誘導后的ADSC變長,部分出現(xiàn)極性改變,免疫細胞化學方法檢測胞漿DSP陽性,RT-PCR檢測DSPP和DMP1陽性表達,表明ADSC已分化為有成牙本質(zhì)細胞表型的細胞。 3.體內(nèi)移植物組織學檢測顯示牙尖樣結(jié)構(gòu)形成,成釉細胞、釉質(zhì)、前期牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細胞由外向內(nèi)平行排列,成牙本質(zhì)細胞處于極化和分泌狀態(tài),DSP染色陽性,進一步說明了ADSC能被誘導分化為成牙本質(zhì)細胞。結(jié)論: 1.脂肪干細胞為多能干細胞,能在體外定向誘導分化為成骨細胞。 2.牙胚細胞條件培養(yǎng)液能在體外誘導脂肪干細胞分化為具有成牙本質(zhì)細胞表型的細胞。 3.將脂肪干細胞與成釉細胞及支架材料復合在體內(nèi)能成功構(gòu)建牙髓-牙本質(zhì)復合體模型。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R78
【圖文】：

干細胞,脂肪,大鼠