【摘要】：年輕恒牙牙根發(fā)育的過程中易受到深齲、外傷、機(jī)械性損傷的影響引起牙髓受損,導(dǎo)致牙根停止發(fā)育,根尖不能完全閉合。臨床上常通過活髓保存術(shù)保存部分或全部牙髓活力,維持牙體組織的正常生長發(fā)育。第三期牙本質(zhì)的形成有助于提高活髓保存術(shù)的成功率,其中新形成的牙本質(zhì)保護(hù)牙髓免受外部刺激和微生物入侵,有利于牙髓組織的長期存活。利用生物材料做為蓋髓劑促進(jìn)第三期牙本質(zhì)形成,提高活髓保存術(shù)的成功率,已在臨床上得到廣泛的研究和應(yīng)用。生物陶瓷類材料如三氧化礦物凝聚體(Mineral Trioxide Aggregate;MTA)、Biodentine等在封閉性、粘接性、生物組織相容性、促進(jìn)生物礦化和誘導(dǎo)牙本質(zhì)分化等性能上有顯著的優(yōu)勢,是臨床上常用的蓋髓劑,但是它們也存在著如凝固時間長、促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)再生的能力有限等問題。近年來,微球負(fù)載具有成骨活性生物分子用于活髓保存術(shù)極具前景。地塞米松(dexamethasone;DEX)是一種合成的糖皮質(zhì)激素,具有廣泛的抗炎、消腫、止痛的作用。其對牙髓干細(xì)胞和牙囊細(xì)胞具有成牙本質(zhì)向分化的作用。與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1;TGF-β1),骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2;BMP-2)等相比,地塞米松是小分子量生物活性物質(zhì),具有半衰期較長,成本低,可用性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但是,超過生理劑量的地塞米松因為可以抑制成骨活性并顯著增加脂質(zhì)的形成,導(dǎo)致組織壞死,不宜全身或者大劑量使用。而采取藥物緩釋系統(tǒng)可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)。藥物緩釋系統(tǒng)的目的就是通過其緩慢釋放作用使藥物在局部微環(huán)境以較低的濃度持續(xù)發(fā)揮治療作用。中空羥基磷灰石(hollow hydroxyapatite microspheres;HHAM)具有良好的生物相容性以及中空核和多孔殼結(jié)構(gòu),可有效提高羥基磷灰石的載藥率,以局部和緩釋方式遞送活性物質(zhì),是藥物分子和其他生物活性因子的良好載體。本課題組前期實(shí)驗已經(jīng)構(gòu)建載地塞米松中空羥基磷灰石微球緩釋系統(tǒng)(dexamethasone-loaded hollow hydroxyapatite microspheres;DHHAM),該系統(tǒng)具有較理想的載藥率和包封率以及體外緩釋效果。且實(shí)驗方法簡單可行、穩(wěn)定可重復(fù)。本實(shí)驗通過體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞(human dental cells;hDPCs)后,檢測DHHAM對hDPCs增殖及成牙向分化的影響,探討該微球緩釋系統(tǒng)在活髓保存術(shù)中臨床應(yīng)用前景。方法:首先合成DHHAM,隨后從人健康的恒牙牙髓組織提取牙髓細(xì)胞,傳代培養(yǎng)后選取第2-4代用于后續(xù)實(shí)驗。通過CCK-8法篩選合適濃度的DHHAM。采用堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅S染色檢測DHHAM對hDPCs的體外礦化能力的影響;qPCR檢測成牙向相關(guān)基因ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達(dá)。結(jié)果:本實(shí)驗中DHHAM載藥率為16.7%,該緩釋系統(tǒng)載藥率良好,在體外緩釋時間可達(dá)30天,延長藥物作用時間,性能優(yōu)良,能發(fā)揮穩(wěn)定的、局部緩慢釋放的作用。DHHAM對hDPCs的增殖影響呈劑量依賴性,且呈反相關(guān),隨著DHHAM濃度的升高,hDPCs的生長受到抑制。通過篩選,1μg/ml的DHHAM作為適宜濃度用于后續(xù)實(shí)驗。hDPCs在相同濃度的DHHAM、DEX、HHAM的作用下,堿性磷酸酶的分泌量從第7天到第14天逐漸升高,且無論在第7天或是14天,DHHAM組堿性磷酸酶的表達(dá)均較其它各組高(P0.05)。茜素紅S染色結(jié)果顯示DHHAM具有更強(qiáng)的促hDPCs細(xì)胞外基質(zhì)礦化的能力。qPCR檢測表明,DHHAM 比DEX以及HHAM顯著促進(jìn)人牙髓細(xì)胞成牙向分化過程中ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:與單獨(dú)使用地塞米松或中空羥基磷灰石相比,該緩釋系統(tǒng)顯著促進(jìn)人牙髓細(xì)胞體外礦化的能力,升高ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達(dá),對hDPCs的牙源性分化具有有利影響,為其做為蓋髓劑用于活髓保存術(shù)動物實(shí)驗中提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R781
【圖文】：

人牙髓組織經(jīng)Ｉ型膠原酶和中性蛋白酶消化后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞逡逑孵箱內(nèi)靜置４天左右，光鏡下即可看到少量ｈＤＰＣｓ從組織塊中“游出”并開始貼逡逑壁生長，一簇一簇呈不規(guī)則的放射狀（圖３．２ａ）。傳代培養(yǎng)后，光鏡下可見ｈＤＰＣｓ逡逑１８逡逑

逡逑呈“漩渦狀”或束狀緊密排列，細(xì)胞形態(tài)變成長梭形（圖３．２ｂ）。逡逑ＨＨＩ逡逑圖３．邋２邋ａ原代細(xì)胞培養(yǎng)４天后，細(xì)胞自組織塊中爬出貼壁生長，一簇一簇呈放射逡逑狀（Ｘ４０）邋；邋ｂ、第二代細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)均一，排列緊密，呈現(xiàn)出“漩逡逑渦狀”邐（Ｘ４０）逡逑３．３邋ＤＨＨＡＭ對人牙髓細(xì)胞體外增殖能力的影響逡逑ＣＣＫ－８結(jié)果顯示（圖３．３），不同濃度的ＤＨＨＡＭ對ｈＤＰＣｓ的增殖的影響逡逑隨著時間變化呈現(xiàn)劑量依賴性。培養(yǎng)一天后，濃度為１００邋ｐｇ／ｍｌ的ＤＨＨＡＭ組對逡逑細(xì)胞有明顯的毒性作用（Ｐ邋＜0．00５），其余各組對細(xì)胞的促進(jìn)或抑制作用不明逡逑顯，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ邋＞０．０５）。培養(yǎng)三天后，濃度為０．０１邋（ｉｇ／ｍｌ、０．１邋ｐｇ／ｍｌ、逡逑１邋ｐｇ／ｍｌ邋的邋ＤＨＨＡＭ邋組均能促進(jìn)邋ｈＤＰＣｓ邋的增殖（Ｐ邋＜０．０５），１０邋ｐｇ／ｍｌ邋的邋ＤＨＨＡＭ逡逑對細(xì)胞增殖無顯著影響（Ｐ邋＞０．０５）

＜０．００５，實(shí)驗重復(fù)三次）逡逑３．４堿性磷酸酶染色及活性檢測逡逑如圖３．４．１和３．４．２所示，整體上，在空白對照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ組）、ＨＨＡＭ組、逡逑ＤＥＸ組、ＤＨＨＡＭ組這四組中，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間從七天延長到十四天，各組逡逑ＡＬＰ的分泌量都呈現(xiàn)出明顯增加的趨勢，紫紅色的染色面積加大，細(xì)胞數(shù)量增逡逑力口。通過ＡＬＰ定量實(shí)驗結(jié)果顯示：ＤＨＨＡＭ組堿性磷酸酶活性顯著高于空白對逡逑照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ組）和ＨＨＡＭ組（Ｐ＜０．００５），第十四天的時候略高于ＤＥＸ組（Ｐ逡逑＜０．０５），而且隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增高（圖３．４．１），圖３．４．２邋ａ－ｄ和ｅ－ｈ分逡逑別為第七天和十四天堿性磷酸酶染色的結(jié)果，與其它三組相比，ＤＨＨＡＭ組細(xì)胞逡逑數(shù)量明顯增加，呈復(fù)層生長；染色較深呈紫紅色，且染色范圍較大，表現(xiàn)出對逡逑ＡＬＰ分泌更大的促進(jìn)優(yōu)勢。陽性對照ＤＥＸ組中的ＡＬＰ表達(dá)雖然低于ＤＨＨＡＭ逡逑組，但較ＨＨＡＭ組和Ｃｏ

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本文編號：2802632