【摘要】：年輕恒牙牙根發(fā)育的過程中易受到深齲、外傷、機械性損傷的影響引起牙髓受損,導致牙根停止發(fā)育,根尖不能完全閉合。臨床上常通過活髓保存術保存部分或全部牙髓活力,維持牙體組織的正常生長發(fā)育。第三期牙本質的形成有助于提高活髓保存術的成功率,其中新形成的牙本質保護牙髓免受外部刺激和微生物入侵,有利于牙髓組織的長期存活。利用生物材料做為蓋髓劑促進第三期牙本質形成,提高活髓保存術的成功率,已在臨床上得到廣泛的研究和應用。生物陶瓷類材料如三氧化礦物凝聚體(Mineral Trioxide Aggregate;MTA)、Biodentine等在封閉性、粘接性、生物組織相容性、促進生物礦化和誘導牙本質分化等性能上有顯著的優(yōu)勢,是臨床上常用的蓋髓劑,但是它們也存在著如凝固時間長、促進牙髓-牙本質再生的能力有限等問題。近年來,微球負載具有成骨活性生物分子用于活髓保存術極具前景。地塞米松(dexamethasone;DEX)是一種合成的糖皮質激素,具有廣泛的抗炎、消腫、止痛的作用。其對牙髓干細胞和牙囊細胞具有成牙本質向分化的作用。與轉化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1;TGF-β1),骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2;BMP-2)等相比,地塞米松是小分子量生物活性物質,具有半衰期較長,成本低,可用性較強的優(yōu)點。但是,超過生理劑量的地塞米松因為可以抑制成骨活性并顯著增加脂質的形成,導致組織壞死,不宜全身或者大劑量使用。而采取藥物緩釋系統(tǒng)可以彌補這一缺點。藥物緩釋系統(tǒng)的目的就是通過其緩慢釋放作用使藥物在局部微環(huán)境以較低的濃度持續(xù)發(fā)揮治療作用。中空羥基磷灰石(hollow hydroxyapatite microspheres;HHAM)具有良好的生物相容性以及中空核和多孔殼結構,可有效提高羥基磷灰石的載藥率,以局部和緩釋方式遞送活性物質,是藥物分子和其他生物活性因子的良好載體。本課題組前期實驗已經構建載地塞米松中空羥基磷灰石微球緩釋系統(tǒng)(dexamethasone-loaded hollow hydroxyapatite microspheres;DHHAM),該系統(tǒng)具有較理想的載藥率和包封率以及體外緩釋效果。且實驗方法簡單可行、穩(wěn)定可重復。本實驗通過體外培養(yǎng)人牙髓細胞(human dental cells;hDPCs)后,檢測DHHAM對hDPCs增殖及成牙向分化的影響,探討該微球緩釋系統(tǒng)在活髓保存術中臨床應用前景。方法:首先合成DHHAM,隨后從人健康的恒牙牙髓組織提取牙髓細胞,傳代培養(yǎng)后選取第2-4代用于后續(xù)實驗。通過CCK-8法篩選合適濃度的DHHAM。采用堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅S染色檢測DHHAM對hDPCs的體外礦化能力的影響;qPCR檢測成牙向相關基因ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達。結果:本實驗中DHHAM載藥率為16.7%,該緩釋系統(tǒng)載藥率良好,在體外緩釋時間可達30天,延長藥物作用時間,性能優(yōu)良,能發(fā)揮穩(wěn)定的、局部緩慢釋放的作用。DHHAM對hDPCs的增殖影響呈劑量依賴性,且呈反相關,隨著DHHAM濃度的升高,hDPCs的生長受到抑制。通過篩選,1μg/ml的DHHAM作為適宜濃度用于后續(xù)實驗。hDPCs在相同濃度的DHHAM、DEX、HHAM的作用下,堿性磷酸酶的分泌量從第7天到第14天逐漸升高,且無論在第7天或是14天,DHHAM組堿性磷酸酶的表達均較其它各組高(P0.05)。茜素紅S染色結果顯示DHHAM具有更強的促hDPCs細胞外基質礦化的能力。qPCR檢測表明,DHHAM 比DEX以及HHAM顯著促進人牙髓細胞成牙向分化過程中ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達(P0.05)。結論:與單獨使用地塞米松或中空羥基磷灰石相比,該緩釋系統(tǒng)顯著促進人牙髓細胞體外礦化的能力,升高ALP、Runx2、OCN、DSPP、DMP-1的表達,對hDPCs的牙源性分化具有有利影響,為其做為蓋髓劑用于活髓保存術動物實驗中提供基礎。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R781
【圖文】：

人牙髓組織經Ｉ型膠原酶和中性蛋白酶消化后接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在細胞逡逑孵箱內靜置４天左右，光鏡下即可看到少量ｈＤＰＣｓ從組織塊中“游出”并開始貼逡逑壁生長，一簇一簇呈不規(guī)則的放射狀（圖３．２ａ）。傳代培養(yǎng)后，光鏡下可見ｈＤＰＣｓ逡逑１８逡逑

逡逑呈“漩渦狀”或束狀緊密排列，細胞形態(tài)變成長梭形（圖３．２ｂ）。逡逑ＨＨＩ逡逑圖３．邋２邋ａ原代細胞培養(yǎng)４天后，細胞自組織塊中爬出貼壁生長，一簇一簇呈放射逡逑狀（Ｘ４０）邋；邋ｂ、第二代細胞，細胞呈長梭形，形態(tài)均一，排列緊密，呈現(xiàn)出“漩逡逑渦狀”邐（Ｘ４０）逡逑３．３邋ＤＨＨＡＭ對人牙髓細胞體外增殖能力的影響逡逑ＣＣＫ－８結果顯示（圖３．３），不同濃度的ＤＨＨＡＭ對ｈＤＰＣｓ的增殖的影響逡逑隨著時間變化呈現(xiàn)劑量依賴性。培養(yǎng)一天后，濃度為１００邋ｐｇ／ｍｌ的ＤＨＨＡＭ組對逡逑細胞有明顯的毒性作用（Ｐ邋＜0．00５），其余各組對細胞的促進或抑制作用不明逡逑顯，不具有統(tǒng)計學意義（Ｐ邋＞０．０５）。培養(yǎng)三天后，濃度為０．０１邋（ｉｇ／ｍｌ、０．１邋ｐｇ／ｍｌ、逡逑１邋ｐｇ／ｍｌ邋的邋ＤＨＨＡＭ邋組均能促進邋ｈＤＰＣｓ邋的增殖（Ｐ邋＜０．０５），１０邋ｐｇ／ｍｌ邋的邋ＤＨＨＡＭ逡逑對細胞增殖無顯著影響（Ｐ邋＞０．０５）

＜０．００５，實驗重復三次）逡逑３．４堿性磷酸酶染色及活性檢測逡逑如圖３．４．１和３．４．２所示，整體上，在空白對照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ組）、ＨＨＡＭ組、逡逑ＤＥＸ組、ＤＨＨＡＭ組這四組中，隨著細胞培養(yǎng)時間從七天延長到十四天，各組逡逑ＡＬＰ的分泌量都呈現(xiàn)出明顯增加的趨勢，紫紅色的染色面積加大，細胞數(shù)量增逡逑力口。通過ＡＬＰ定量實驗結果顯示：ＤＨＨＡＭ組堿性磷酸酶活性顯著高于空白對逡逑照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ組）和ＨＨＡＭ組（Ｐ＜０．００５），第十四天的時候略高于ＤＥＸ組（Ｐ逡逑＜０．０５），而且隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增高（圖３．４．１），圖３．４．２邋ａ－ｄ和ｅ－ｈ分逡逑別為第七天和十四天堿性磷酸酶染色的結果，與其它三組相比，ＤＨＨＡＭ組細胞逡逑數(shù)量明顯增加，呈復層生長；染色較深呈紫紅色，且染色范圍較大，表現(xiàn)出對逡逑ＡＬＰ分泌更大的促進優(yōu)勢。陽性對照ＤＥＸ組中的ＡＬＰ表達雖然低于ＤＨＨＡＭ逡逑組，但較ＨＨＡＭ組和Ｃｏ

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本文編號：2802632