【摘要】：背景：口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma(OSCC))是世界上最常見的惡性腫瘤之一,全世界每年幾乎有超過350000人被診斷出患有OSCC。[1]其發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟、階梯式的過程,且自始至終需要有致癌因素導致的遺傳學改變的不斷積累。建立與人類口腔癌相似的動物模型,有利于探討口腔癌的病因、發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移�？谇话﹦游锬Ｐ偷慕⒎椒ㄓ卸喾N,化學試劑誘導發(fā)生口腔惡性腫瘤是最常見的一種。水溶性致癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitro-quinoline-1-oxide,4NQO)是一種化學前體致癌劑,近年來學者采用4NQO涂布或飲水法成功地誘導大鼠舌癌病變。檳榔堿(Arecoline)是檳榔中的提取物,目前發(fā)現(xiàn)用于多種動物的多種誘癌模型,包括肺,肝,胃。不同種系的鼠對4NQO誘發(fā)舌癌的敏感性有所不同,目前國內對小鼠舌癌模型的報道僅限于Balb/c品系的小鼠而未見C57BL/6品系小鼠的報道,誘癌劑均單純運用4NQO。本研究嘗試單獨和聯(lián)合運用4NQO和檳榔堿(Arecoline)模擬有咀嚼檳榔習慣的口腔癌患者的病因元素,有助于進一步研究口腔癌的病因和發(fā)病機制。為活體熒光影像系統(tǒng)的建立重要的實驗動物模型。 目的：本研究利用化學致癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)和檳榔堿(Arecoline),構建GFP轉基因Babl/c和C57BL/6小鼠舌癌模型并觀察其余臟器相關病變,對小鼠舌組織病理形態(tài)進行動態(tài)觀察,并對誘癌劑的不同劑量及不同方法,兩個鼠種的誘癌過程和誘癌率進行比較,以期獲得與人類舌癌發(fā)生發(fā)展最相似及誘癌率高的病變模型的誘癌方法。同時實驗以綠色熒光蛋白轉基因小鼠為實驗對象,通過觀察綠色熒光蛋白在GFP轉基因小鼠癌變過程中組織里的表達情況。為活體熒光影像系統(tǒng)的建立提供重要實驗依據(jù),為相關的基礎研究提供動物模型與細胞來源。 方法：以GFP轉基因Babl/c和C57BL/6兩個種系小鼠為實驗對象,通過分別單獨和聯(lián)合應用4NQO和Arecoline,嘗試不同濃度飲水和涂布兩種方法建立小鼠舌癌及淋巴結轉移模型。觀察綠色熒光蛋白在GFP轉基因小鼠癌變過程中組織里的表達情況。主要構建方法如下：隨機選取GFP轉基因小鼠按種系不同分為兩組。A組為GFP轉基因Balb/c近交系小鼠；B組為GFP轉基因C57BL/6近交系小鼠；各70只。A、B兩組又各隨機分為7個亞組,每個亞組10只,第1組為對照組飲用自來水；2-7組為實驗組,實驗組分別以涂布法5mg/ml4NQO;自然飲水法20μg/ml,50μg/ml,100μg/ml4NQO,500μg/mlArecoline,及聯(lián)合應用100μg/ml4NQO和500μg/mlArecoline。各組誘癌劑飲用至16周時,改為飲用滅菌自來水觀察至第40周,于誘癌的不同節(jié)點選取狀態(tài)不佳,體重下降超過20%的小鼠處死,取其舌頭、食管、胃、肝、脾臟組織標本,通過肉眼和組織學觀察腫瘤發(fā)生發(fā)展情況。 綠色熒光蛋白在GFP轉基因小鼠癌變過程中組織里的表達觀察：①癌變過程中的不同節(jié)點處死小鼠后選取新鮮舌頭置于分子成像系統(tǒng)觀察對比GFP在腫物和周圍組織中的表達。②新鮮病變舌組織行冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察組織熒光表達,記錄GFP在癌變不同進程階段組織中的表達情況。③成功建模后取小鼠新鮮舌頭腫物原代培養(yǎng),觀察細胞培養(yǎng)形態(tài),置于熒光顯微鏡下動態(tài)記錄腫瘤細胞的熒光表達情況。 結果：對照小鼠舌背粘膜呈粉紅色富有彈性,舌體柔軟,舌乳頭分布均勻,無白色樣變和新生物形成。隨著誘癌劑作用時間和觀察時間的延長,實驗小鼠的舌粘膜相繼出現(xiàn)充血水腫、紅白斑、疣狀新生物、潰瘍等改變。病理學證實A組GFP轉基因Babl/c和B組C57BL/6實驗小鼠舌粘膜皆出現(xiàn)由過度角化-輕度異常增生-中度異常增生-重度異常增生-原位癌-浸潤性癌的改變。其中A組GFP轉基因Babl/c小鼠誘癌情況如下：A2組80.0%(8/10)為過度角化,20.0%(2/10)為輕度異常增生,10.0%(1/10)為中度異常增生；A3組40.0%(4/10)為過度角化,60.0%(6/10)為輕度異常增生,20.0%(2/10)為中度異常增生,10.0%(1/10)為重度異常增生；A4組60.0%(6/10)為過度角化,70.0%(7/10)為輕度異常增生,40.0%(4/10)為中度異常增生,20.0%(2/10)為重度異常增生,10.0%(1/10)為原位癌；A5組90.0%(9/10)為過度角化,70.0%(7/10)為輕度異常增生,40.0%(4/10)為中度異常增生,30.0%(3/10)為重度異常增生,20.0%(2/10)為原位癌,10.0%(1/10)為早期浸潤癌；A6組20.0%(2/10)為過度角化；A7組90.0%(9/10)為過度角化,10.0%(1/10)為輕度異常增生,20.0%(2/10)為中度異常增生,40.0%(4/10)為重度異常增生,20.0%(2/10)為原位癌,20.0%(2/10)為浸潤癌,10.0%(1/10)淋巴結轉移,20.0%(2/10)食管異常增生。 B組GFP轉基因C57BL/6小鼠誘癌情況如下：B2組30.0%(3/10)為過度角化,20.0%(2/10)為輕度異常增生；B3組50.0%(5/10)為過度角化,60.0%(6/10)為輕度異常增生,10.0%(1/10)為中度異常增生；B4組50.0%(5/10)為過度角化,40.0%(4/10)為輕度異常增生,20.0%(2/10)為中度異常增生,30.0%(3/10)為重度異常增生,10.0%(1/10)為原位癌；B5組50.0%(5/10)為過度角化,40.0%(4/10)為輕度異常增生,30.0%(3/10)為中度異常增生,30.0%(3/10)為重度異常增生,10.0%(1/10)為原位癌,20.0%(2/10)為浸潤癌。B6組20.0%(2/10)為過度角化；B7組80.0%(8/10)為過度角化,10.0%(1/10)為輕度異常增生,10.0%(1/10)為中度異常增生,40.0%(4/10)為重度異常增生,10.0%(1/10)為原位癌,70%(7/10)為浸潤癌；10%(1/10)頸部淋巴結轉移,20%(2/10)食管異常增生。 結論：1.4NQO能成功建立小鼠產(chǎn)生舌癌模型,100μg/ml濃度4NOO誘發(fā)的病變模型生長緩慢組織病理學特征與人相似。聯(lián)合運用Arecoline和4NQO是誘癌率最高的建模方法。 2.C57BL/6小鼠相較Babl/c小鼠誘癌率高,死亡率低,更適宜作為誘癌效率高的模型對象。 3.GFP在舌組織癌變過程中丟失,此模型不宜作為構建熒光腫瘤細胞來源模型。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.86

【參考文獻】

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1 李曉杰;馬國武;李武偉;;4NQO飲水法誘發(fā)小鼠舌癌動物模型建立的研究[J];口腔醫(yī)學研究;2006年05期

2 夏來新,程漢華,郭一清,周榮家;黃鱔β-actin基因的克隆及其在魚類中的系統(tǒng)發(fā)生分析(英文)[J];遺傳學報;2005年07期

3 劉興坤,何榮根,陳萬濤,周曾同,孫春曉,李偉國,周曉健;4NQO飲水誘發(fā)大鼠舌癌模型的建立[J];中華口腔醫(yī)學雜志;1999年06期

本文編號：2800405