【摘要】：巨頜癥(Cherubism)是一種以領(lǐng)骨骨吸收為特征的遺傳病,有大量破骨細(xì)胞分布其中。其致病基因SH3BP2編碼的蛋白是一種接頭蛋白,它在破骨細(xì)胞的分化過程中起重要的作用,當(dāng)其表達(dá)在小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞Raw264.7中被阻斷后,Raw264.7不能分化為成熟的破骨細(xì)胞。巨頜癥中的的SH3BP2突變是一類功能獲得型突變,它能夠上調(diào)破骨前體細(xì)胞對破骨細(xì)胞分化因子(receptor activor of NF-Kb ligand,RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factors,M-CSF)的應(yīng)答。RANKL是誘導(dǎo)生成破骨細(xì)胞的必需因子,它與M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化是破骨細(xì)胞生成的經(jīng)典途徑。由于體內(nèi)破骨細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞相混雜、數(shù)量少、難于分離,所以研究中通常通過體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化得到破骨細(xì)胞,但是因?yàn)閱魏思?xì)胞來源有限或者誘導(dǎo)困難,導(dǎo)致體外誘導(dǎo)得到的成熟的破骨細(xì)胞數(shù)量也很少,這已成為了阻礙研究破骨細(xì)胞某些功能的一個(gè)瓶頸。目前通過對蛋白SH3BP2的研究,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些能與蛋白SH3BP2相互作用并參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的信號分子(Syk,Src,PLCy),但是僅僅通過這些信號分子,還不足以闡明SH3BP2對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用,可能還存在能與其相互作用的其它的蛋白。因此找出這些蛋白,可進(jìn)一步完善蛋白SH3BP2參與的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的信號通路,為揭示疾病的發(fā)生過程,制定合理的基因治療計(jì)劃的提供基礎(chǔ)。 目的： ①建立一個(gè)有效的誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)體系,解決破骨細(xì)胞來源問題。 ②構(gòu)建SH3BP2突變體質(zhì)粒,并在單核細(xì)胞中表達(dá),為研究蛋白SH3BP2調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的機(jī)制建立一個(gè)平臺。 ③尋找新的可能參與到破骨細(xì)胞分化中且可與SH3BP2相互作用的蛋白,根據(jù)這個(gè)蛋白的功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn),研究SH3BP2調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的作用。 方法： ①RANKL和M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞PBMCs和臍帶血單核細(xì)胞UBMCs)向多核破骨樣細(xì)胞分化,比較破骨細(xì)胞的形態(tài)和分化時(shí)間,選擇易于體外誘導(dǎo)分化的單核細(xì)胞。 ②選擇四種SH3BP2基因突變體,構(gòu)建質(zhì)粒載體。并嘗試將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到單核細(xì)胞中。 ③通過生物信息學(xué)預(yù)測可能與SH3BP2相互作用的蛋白。免疫組織化學(xué)染色檢測該蛋白在病變中的破骨細(xì)胞以及單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)。如果有表達(dá),則通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測兩種蛋白在破骨細(xì)胞中是否有相互作用。 結(jié)果： ①THP-1, PBMCs, UBMCs三者比較,在形態(tài)上UBMCs生成的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)量最多,其次是THP-1,最少是PBMCs。在誘導(dǎo)時(shí)間上,THP-1最快分化完成。 ②構(gòu)建野生型和四種突變型SH3BP2質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到THP-1細(xì)胞中,但是不能表達(dá)蛋白。UBMCs在向破骨細(xì)胞分化的第14天能夠進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。 ③FLT-3和SH3BP2同時(shí)在巨頜癥破骨細(xì)胞中和單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的過程中都有表達(dá)。 結(jié)論： ①THP-1細(xì)胞能夠在RANKL和M-CSF的聯(lián)合刺激下分化生成破骨細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞。 ②構(gòu)建了四種SH3BP2突變質(zhì)粒,并在293細(xì)胞中檢測到蛋白的表達(dá)。但是THP-1細(xì)胞不能表達(dá)質(zhì)粒編碼的SH3BP2蛋白。 ③臍血單核細(xì)胞在分化到一定程度以后(lipofectimaine2000是在5天),應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法能夠轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞中。 ④FLT-3可能參與了SH3BP2調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的過程。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R782
【圖文】：

檢測質(zhì)粒序列和蛋白的表達(dá)通過測序，確定質(zhì)粒中SH3BPZ基因突變正確，其它位點(diǎn)沒有突變。之后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，48h后檢測到蛋白的表達(dá)(圖3)。 FIagS日3B尸2 1:Pro， LeU418 2:Pro·A一’ 94183:P!·O卜 H154184:ASP， Gly419圖3:將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，48h后提取細(xì)胞全蛋自， westemblot檢測蛋白SH3BPZ的表達(dá)。A:一抗為Flag抗體，檢測到蛋自的表達(dá)B:一抗為人sH3BPZ抗體，檢測至lJ蛋自的表達(dá)。2.3討論在巨領(lǐng)癥中不排除不同的基因突變型對應(yīng)相同的臨床表現(xiàn)型，除了基因突變類型外可能還有其他的體內(nèi)因素導(dǎo)致臨床表現(xiàn)的不同。所以為了觀察單純的基因突變類型對臨床表現(xiàn)的影響

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測巨領(lǐng)癥破骨細(xì)胞是否表達(dá)蛋白FLT一3和SH3BPZ，以胞漿呈棕色著色為陽性標(biāo)志，結(jié)果顯示兩種蛋白在巨領(lǐng)癥破骨細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)(圖7)。，、、，‘-，.、戶·

本文編號：2799279