【摘要】：巨頜癥(Cherubism)是一種以領骨骨吸收為特征的遺傳病,有大量破骨細胞分布其中。其致病基因SH3BP2編碼的蛋白是一種接頭蛋白,它在破骨細胞的分化過程中起重要的作用,當其表達在小鼠破骨細胞前體細胞Raw264.7中被阻斷后,Raw264.7不能分化為成熟的破骨細胞。巨頜癥中的的SH3BP2突變是一類功能獲得型突變,它能夠上調破骨前體細胞對破骨細胞分化因子(receptor activor of NF-Kb ligand,RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factors,M-CSF)的應答。RANKL是誘導生成破骨細胞的必需因子,它與M-CSF聯(lián)合誘導單核細胞向破骨細胞分化是破骨細胞生成的經(jīng)典途徑。由于體內破骨細胞與間質細胞相混雜、數(shù)量少、難于分離,所以研究中通常通過體外誘導單核細胞分化得到破骨細胞,但是因為單核細胞來源有限或者誘導困難,導致體外誘導得到的成熟的破骨細胞數(shù)量也很少,這已成為了阻礙研究破骨細胞某些功能的一個瓶頸。目前通過對蛋白SH3BP2的研究,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些能與蛋白SH3BP2相互作用并參與調節(jié)破骨細胞分化的信號分子(Syk,Src,PLCy),但是僅僅通過這些信號分子,還不足以闡明SH3BP2對破骨細胞分化的調控作用,可能還存在能與其相互作用的其它的蛋白。因此找出這些蛋白,可進一步完善蛋白SH3BP2參與的調節(jié)破骨細胞分化的信號通路,為揭示疾病的發(fā)生過程,制定合理的基因治療計劃的提供基礎。 目的： ①建立一個有效的誘導單核細胞向破骨細胞分化的誘導體系,解決破骨細胞來源問題。 ②構建SH3BP2突變體質粒,并在單核細胞中表達,為研究蛋白SH3BP2調節(jié)破骨細胞分化的機制建立一個平臺。 ③尋找新的可能參與到破骨細胞分化中且可與SH3BP2相互作用的蛋白,根據(jù)這個蛋白的功能結構特點,研究SH3BP2調節(jié)破骨細胞分化的作用。 方法： ①RANKL和M-CSF聯(lián)合誘導破骨細胞前體細胞(單核細胞系THP-1細胞、外周血單核細胞PBMCs和臍帶血單核細胞UBMCs)向多核破骨樣細胞分化,比較破骨細胞的形態(tài)和分化時間,選擇易于體外誘導分化的單核細胞。 ②選擇四種SH3BP2基因突變體,構建質粒載體。并嘗試將質粒轉染到單核細胞中。 ③通過生物信息學預測可能與SH3BP2相互作用的蛋白。免疫組織化學染色檢測該蛋白在病變中的破骨細胞以及單核細胞向破骨細胞分化過程中的表達。如果有表達,則通過免疫共沉淀實驗,檢測兩種蛋白在破骨細胞中是否有相互作用。 結果： ①THP-1, PBMCs, UBMCs三者比較,在形態(tài)上UBMCs生成的破骨細胞樣細胞的細胞核數(shù)量最多,其次是THP-1,最少是PBMCs。在誘導時間上,THP-1最快分化完成。 ②構建野生型和四種突變型SH3BP2質粒。轉染質粒到THP-1細胞中,但是不能表達蛋白。UBMCs在向破骨細胞分化的第14天能夠進行質粒轉染。 ③FLT-3和SH3BP2同時在巨頜癥破骨細胞中和單核細胞向破骨細胞分化的過程中都有表達。 結論： ①THP-1細胞能夠在RANKL和M-CSF的聯(lián)合刺激下分化生成破骨細胞樣形態(tài)的細胞。 ②構建了四種SH3BP2突變質粒,并在293細胞中檢測到蛋白的表達。但是THP-1細胞不能表達質粒編碼的SH3BP2蛋白。 ③臍血單核細胞在分化到一定程度以后(lipofectimaine2000是在5天),應用脂質體轉染方法能夠轉染質粒進入細胞中。 ④FLT-3可能參與了SH3BP2調節(jié)破骨細胞分化的過程。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R782
【圖文】：

檢測質粒序列和蛋白的表達通過測序，確定質粒中SH3BPZ基因突變正確，其它位點沒有突變。之后將質粒轉染入293細胞中，48h后檢測到蛋白的表達(圖3)。 FIagS日3B尸2 1:Pro， LeU418 2:Pro·A一’ 94183:P!·O卜 H154184:ASP， Gly419圖3:將質粒轉染入293細胞中，48h后提取細胞全蛋自， westemblot檢測蛋白SH3BPZ的表達。A:一抗為Flag抗體，檢測到蛋自的表達B:一抗為人sH3BPZ抗體，檢測至lJ蛋自的表達。2.3討論在巨領癥中不排除不同的基因突變型對應相同的臨床表現(xiàn)型，除了基因突變類型外可能還有其他的體內因素導致臨床表現(xiàn)的不同。所以為了觀察單純的基因突變類型對臨床表現(xiàn)的影響

應用免疫組織化學染色檢測巨領癥破骨細胞是否表達蛋白FLT一3和SH3BPZ，以胞漿呈棕色著色為陽性標志，結果顯示兩種蛋白在巨領癥破骨細胞中均呈陽性表達(圖7)。，、、，‘-，.、戶·

本文編號：2799279