【摘要】： 目的 牙髓卟啉單胞菌(Porphyromomanus endodontalis, P.e)是牙髓根尖周病感染根管中的優(yōu)勢菌,為革蘭陰性厭氧菌,其細(xì)胞壁外膜上的內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides,LPS)是重要的毒力因子。在根尖周病的骨組織病變中,成骨細(xì)胞作用關(guān)鍵,既可分泌礦化基質(zhì)形成骨組織,又可分泌炎癥因子,促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察P.e-LPS對成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)分泌情況的影響,探討P.e-LPS在成骨細(xì)胞增殖與分化過程中的作用。 材料與方法 1、細(xì)菌培養(yǎng) 應(yīng)用腦心浸液(Brain heart infusion,BHI)固體培養(yǎng)基在37℃、厭氧條件(含80%N2、10%CO2、10%H2)下復(fù)蘇培養(yǎng)P.e,BHI液體培養(yǎng)基增菌后收集細(xì)菌,-20℃保存。 2、內(nèi)毒素提取 采用熱酚水法提取P.e-LPS,應(yīng)用凝膠鱟試劑法對所提取內(nèi)毒素進(jìn)行定性分析。 3、細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)生長于含10%胎牛血清、100u／ml青霉素、100u／ml鏈霉素的MEM-a培養(yǎng)基中,置于含5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的第3、4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 4、細(xì)胞增殖率檢測 將終濃度為10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h,并設(shè)置未加P.e-LPS的對照組,MTT法于490nm波長處檢測OD值。 5、ALP活性測定 將終濃度為10、25、50μg／ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞6、12、24和48h,并設(shè)置未加P.e-LPS的對照組,ALP試劑盒于520nm波長處測OD值。 6、ELISA法檢測IL-6 將終濃度為10、25、50μg/ml的P.e-LPS,作用于MC3T3-E1細(xì)胞48h；根據(jù)劑量組結(jié)果,選擇最佳濃度P.e-LPS作用細(xì)胞6、12、24、48h,并設(shè)置未加P.e-LPS組做對照,ELISA試劑盒于450nm波長處檢測OD值。 7、統(tǒng)計學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)。顯著水平：P0.05時有顯著性差異,P0.01時有高度顯著性差異。 結(jié)果 1、P.e-LPS作用于MC3T3-E1細(xì)胞,72h時25μg／ml組細(xì)胞相對增殖率(Relative growth rate, RGR)為87.464%,低于對照組(P0.05),50μg/ml組RGR顯著為71.117%,顯著低于對照組(P0.01)。 2、P.e-LPS作用6h時,各濃度的ALP活性的下降水平與對照組無顯著性差異。當(dāng)P.e-LPS作用12h時,50μg／ml組ALP活性下降與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。P.e-LPS作用24h后,各濃度組ALP活性均下降(P0.05)。 3、作用48h時,與0μg/ml組比較,10、25和50μg／ml組IL-6的分泌量均顯著增加(P0.01),但50μg／ml組IL-6分泌量少于25μg／ml組。將25μg／ml組作用于MC3T3-E1后,與對照組相比較,在6h時IL-6表達(dá)有所增加(P0.05),隨著作用時間延長,IL-6表達(dá)顯著增加(P0.01)。 結(jié)論 1、P.e-LPS使MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性降低,抑制了MC3T3-E1的分化； 2、在P.e-LPS長時間毒力刺激作用下,MC3T3-E1相對增殖率也顯著下降。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R781.3
【圖文】：

不同濃度P.e一LPS作用下MC3T3一E1的堿性磷酸酶活性的比較

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 侯本祥,史俊南;內(nèi)毒素刺激單核細(xì)胞培養(yǎng)上清對人牙髓細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2004年03期

2 劉琨;侯本祥;;牙髓卟啉單胞菌的毒力因子及其致病性[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2007年01期

3 湯亞玲;牙髓卟啉單胞菌的生物學(xué)特性與致病性[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;2003年02期

4 蘇勤,何國華,張郁,李強(qiáng);內(nèi)毒素對重組人成骨蛋白-1誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞活性的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;1999年02期

5 楊諦;李任;仇麗鴻;李琛;;牙髓卟啉單胞菌內(nèi)毒素對成骨細(xì)胞表達(dá)IL-1β mRNA和IL-6 mRNA的影響[J];上海口腔醫(yī)學(xué);2009年02期

6 郭希民,牛忠英,肖明振,岳玲,陸懷秀;炎癥人牙髓組織滲出液中IL-8含量的檢測[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年03期

7 史俊南,唐榮銀,文玲英,趙守亮,張亞慶,陳強(qiáng),顧淑萍,蘇凌云,王捍國,余擎,陸群,張瑩,田宇,王曉方,孫漢堂,王英,王勝朝,周澤淵,賀慧霞,王亦菁;25年來我們在牙髓生物學(xué)方面的研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2005年01期

8 李楠,王和鳴;體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞研究新進(jìn)展[J];中國骨傷;2003年03期

9 嚴(yán)杰，方平楚;幽門螺桿菌脂多糖生物學(xué)活性的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1994年03期

10 李任;仇麗鴻;;牙髓卟啉單胞菌內(nèi)毒素致病性研究進(jìn)展[J];中國實(shí)用口腔科雜志;2009年12期

本文編號：2798711