【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.觀察研究HIF-1α在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及與CEACAM1、VEGF-C表達(dá)的關(guān)系,分析CEACAM1對(duì)血管和淋巴管生成的影響,初步探討HIF-1α、CEACAM1、VEGF-C在口腔癌血管和淋巴管生成中的作用及可能的機(jī)制。 2.觀察RNAi基因沉默HIF-1α對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113表達(dá)HIF-1α的影響,并觀察研究HIF-1α基因沉默對(duì)CEACAM1和VEGF-C表達(dá)的影響,探討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C的調(diào)控關(guān)系及在腫瘤脈管生成中的作用機(jī)制。 3.以口腔癌裸鼠移植瘤模型為研究對(duì)象,研究HIF-1α基因沉默對(duì)腫瘤CEACAM1和VEGF-C表達(dá)的影響,驗(yàn)證HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C對(duì)腫瘤血管和淋巴管生成的作用,以及對(duì)腫瘤增殖和進(jìn)展的影響；探討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C通路對(duì)腫瘤脈管生成及其正常化的影響及作用機(jī)制。 研究方法： 1.以人口腔鱗狀細(xì)胞癌為研究對(duì)象,檢測(cè)人口腔鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C表達(dá) 收集2005-2007年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔癌手術(shù)標(biāo)本91例,其中包括舌鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本30例�；颊吲R床資料包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)HIF-1α和CEACAM1在91例口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及定位,并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析,評(píng)價(jià)蛋白的表達(dá)與臨床資料之間的關(guān)系。檢測(cè)30例舌鱗狀細(xì)胞癌中VEGF-C表達(dá),并與HIF-1α和CEACAM1在舌癌中的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比,統(tǒng)計(jì)分析HIF-1α與CEACAM1和VEGF-C在舌癌中表達(dá)的相關(guān)性,并進(jìn)一步分析在HIF-1α高表達(dá)情況下,CEACAM1表達(dá)與腫瘤脈管生成的關(guān)系。 2.以人口腔癌為研究對(duì)象,檢測(cè)人口腔癌中MVD和LVD以及脈管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化情況 采用免疫組化方法,分別應(yīng)用血管標(biāo)記CD31和淋巴管標(biāo)記LYVE-1檢測(cè)口腔癌中血管和淋巴管生成情況,統(tǒng)計(jì)血管密度和淋巴管密度。免疫組化雙標(biāo)記和免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)新生脈管表型轉(zhuǎn)化情況,并分析其與CEACAM1表達(dá)的關(guān)系。 3、以人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞為研究對(duì)象,檢測(cè)RNAi慢病毒干擾載體對(duì)Tca8113細(xì)胞HIF-1α基因的干擾效率 Tca8113細(xì)胞在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以4×104／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2m1DMEM培養(yǎng)基。48小時(shí)后,細(xì)胞融合率可達(dá)到30-50%。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性載體對(duì)照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP-Lentivirus和HIF-1 a-RNAi-Lentivirus(復(fù)感染指數(shù)MOI為75),37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。每天倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長,通過觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況,評(píng)估感染效率。RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評(píng)估細(xì)胞感染率約為70-80%,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用Real time RT-PCR方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α基因水平表達(dá),Realtime RT-PCR數(shù)值分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平。 4.以Tca8113細(xì)胞為研究對(duì)象,檢測(cè)HIF-1α沉默對(duì)CEACAM1、VEGF-C基因和蛋白水平表達(dá)的影響 Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)并感染慢病毒顆粒,RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評(píng)估細(xì)胞感染率約為70-80%,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C基因水平的表達(dá),real time RT-PCR數(shù)值分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α的蛋白表達(dá),再次驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平干擾效率。同時(shí)收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CEACAM1的表達(dá)。RNA干擾后第五天收集Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)液上清,采用ELISA方法對(duì)分泌至細(xì)胞外的VEGF-C蛋白進(jìn)行檢測(cè)。分析三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組中Tca8113細(xì)胞HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C在基因和蛋白水平表達(dá)情況,探討HIF-1α基因沉默后對(duì)CEACAM1和VEGF-C表達(dá)的影響。 5.建立HIF-1α基因沉默的口腔癌裸鼠移植瘤模型并觀察脈管生成及腫瘤進(jìn)展 觀察口腔癌裸鼠移植瘤的增殖進(jìn)展和荷瘤鼠生存情況,檢測(cè)移植瘤增殖活性及CEACAM1和VEGF-C表達(dá)情況,觀察腫瘤脈管生成情況及其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化情況,分析HIF-1α基因沉默與CEACAM1和VEGF-C表達(dá)及脈管生成的關(guān)系。 建立口腔癌裸鼠移植瘤模型：37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞,將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以4×104／孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2m1DMEM培養(yǎng)基。48小時(shí)后,細(xì)胞融合率可達(dá)到30-50%。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP慢病毒顆粒和HIF-1 a-RNAi慢病毒載體(復(fù)感染指數(shù)MOI為75),37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)配制細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為2×106個(gè)／ml,備用。5周齡的BALB/C nu/nu雌性裸鼠30只,(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所),分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組,每組10只,注射0.1ml空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組Tca8113細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)量為2×105個(gè))于裸鼠背部皮下。接種腫瘤細(xì)胞后,將裸鼠置于SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),每天觀察裸鼠背部的成瘤情況并在成瘤后定期對(duì)腫瘤大小進(jìn)行測(cè)量。 四周后每組裸鼠中的5只分別乙醚吸入麻醉后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)活體成像,然后脫頸處死,收集腫瘤標(biāo)本。將收集的裸鼠腫瘤標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理制備成蠟塊,應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)三組裸鼠腫瘤標(biāo)本中CEACAM1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1(抗鼠)和CD31(抗鼠)的表達(dá),并計(jì)數(shù)評(píng)估MVD和LVD,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,免疫雙標(biāo)記法檢測(cè)新生脈管內(nèi)皮細(xì)胞表型變化,研究HIF-1α基因沉默后對(duì)裸鼠移植瘤血管和淋巴管生成及其形態(tài)學(xué)改變和正常化的影響。 6.觀察口腔癌裸鼠移植瘤模型生存情況 三組裸鼠每組剩余5只繼續(xù)在SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),觀察研究荷瘤鼠生存情況,并進(jìn)行生存分析。 結(jié)果： 1.HIF-1α在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),并與CEACAM1和VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān) HIF-1α在腫瘤中高表達(dá)(口腔癌陽性率95%,舌癌陽性率100%),細(xì)胞核和細(xì)胞漿著色；CEACAM1在腫瘤中表達(dá)增高(口腔癌中陽性率為83.5%,舌癌陽性率80%),胞膜和胞漿著色；VEGF-C在腫瘤中表達(dá)增高(舌癌陽性率為90%),胞膜胞漿著色。HIF-1α表達(dá)與CEACAM1和VEGF-C呈正相關(guān)(r=1.26, P0.05; r=1.45, P0.05) 2. CEACAM1表達(dá)模式與口腔癌分化密切相關(guān),并與腫瘤脈管生成和內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān) CEACAM1在口腔高分化鱗狀細(xì)胞癌中呈胞膜陽性表達(dá),在中分化和低分口腔癌中呈胞漿陽性表達(dá)(P＜0.01)。在60例CEACAM1陽性的中分化和低分化癌中,有50例顯示胞漿呈中到高表達(dá),染色范圍從33%到80%,與此形成鮮明對(duì)比的是在20例高分化癌中,16例顯示胞膜陽性表達(dá)。在CEACAM1陽性病例中,CEACAM1陽性的脈管數(shù)量較陰性病例中顯著增高(P＜0.001)；同時(shí),CEACAM1陽性病例比CEACAM1陰性病例MVD和LVD都顯著增加(P＜0.05)；CEACAM1和LYVE-1免疫熒光雙標(biāo)記顯示雙標(biāo)記陽性脈管數(shù)量在CEACAM1陽性病例中數(shù)量增加(P＜0.001)；LYVE-1和CD31免疫組化雙標(biāo)記陽性脈管在CEACAM1胞漿陽性表達(dá)病例中升高(P＜0.001)。 3.RNAi慢病毒干擾載體有效抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達(dá) Real time RT-PCR和western blot檢測(cè)Tca8113細(xì)胞系中HIF-1α干擾效率：RNA干擾基因沉默HIF-1α后,Tca8113細(xì)胞基因水平和蛋白水平HIF-1α表達(dá)均明顯降低(P＜0.05),基因水平表達(dá)下降80%,蛋白水平表達(dá)降低50%。 4.基因沉默HIF-1α后CEACAM1基因水平和蛋白水平表達(dá)下調(diào) Real time RT-PCR和FCM(流式細(xì)胞術(shù))分別檢測(cè)各組Tca8113細(xì)胞CEACAM1表達(dá),干擾組較對(duì)照組CEACAM1在基因水平和蛋白水平表達(dá)均降低。FCM結(jié)果顯示CEACAM1蛋白在空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組表達(dá)率分別為10.30%、12.73%和5.49%(P＜0.05)。 5.基因沉默HIF-1α后VEGF-C基因水平和蛋白水平表達(dá)下調(diào) Real time RT-PCR和ELISA檢測(cè)各組Tca8113細(xì)胞VEGF-C基因水平和蛋白水平表達(dá),ELISA結(jié)果顯示干擾組VEGF-C較對(duì)照組表達(dá)明顯降低與空白對(duì)照組(P=0.029)和陰性對(duì)照組(P=0.032)比較具有顯著差異性,表明HIF-1α基因沉默顯著下調(diào)VEGF-C表達(dá)。 6.HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型中CEACAM1和VEGF-C表達(dá)顯著下調(diào),脈管生成明顯減弱,形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯的正常化趨勢(shì) 免疫組化方法檢測(cè)裸鼠移植瘤模型中CEACAM1、VEGF-C表達(dá)及脈管生成情況：干擾組較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組CEACAM1表達(dá)明顯降低(P＜0.05),MVD和LVD明顯降低(P＜0.05),并且形態(tài)趨于正�；�,管壁完整,內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù),管腔規(guī)則,直徑變小。干擾組與對(duì)照組相比,管腔直徑差異性顯著(P＜0.001)。LYVE-1和CD31雙標(biāo)記陽性脈管在干擾組中顯著減少(P＜0.05)。結(jié)果表明腫瘤HIF-1α基因沉默后,脈管生成受到抑制,并且新生脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)趨于正常。 7.HIF-1α基因沉默降低口腔癌裸鼠移植瘤增殖活性,降低腫瘤生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期 RNA干擾組及陰性載體對(duì)照組和空白對(duì)照組裸鼠移植瘤生長曲線顯示,干擾組移植瘤生長速度明顯減慢(P＜0.05),可能與HIF-1α沉默導(dǎo)致受HIF-1α調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)基因活性降低,使得腫瘤細(xì)胞增殖降低。干擾組移植瘤Ki-67表達(dá)明顯降低(P＜0.005),說明HIF-1α沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性減弱。 裸鼠生存曲線分析顯示：干擾組裸鼠生存時(shí)間較空白對(duì)照和陰性對(duì)照明顯延長(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.HIF-1α在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),并且與CEACAM1和VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)。CEACAM1表達(dá)與腫瘤分化程度關(guān)系密切,并與腫瘤脈管生成相關(guān)。CEACAM1陽性病例中,血管和淋巴管生成顯著增高,內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化也更活躍,這表明在HIF-1α高表達(dá)口腔癌中,HIF-1α可能通過調(diào)控CEACAM1和VEGF-C的表達(dá),促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管生成,并對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化具有重要作用。 2.體外實(shí)驗(yàn)顯示HIF-1α基因沉默顯著抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達(dá),同時(shí)隨著HIF-1α表達(dá)降低,CEACAM1和VEGF-C在基因水平和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。這表明在人口腔癌中HIF-1α可以調(diào)控CEACAM1和VEGF-C表達(dá),HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能在口腔癌脈管生成中具有重要作用。 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型HIF-1α表達(dá)明顯降低,腫瘤血管和淋巴管生成被顯著抑制,并且脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯趨于正常,血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化也更趨穩(wěn)定,同時(shí),干擾組移植瘤CEACAM1和VEGF-C表達(dá)都明顯下調(diào),表明RNA干擾基因沉默HIF-1α后,通過下調(diào)CEACAM1和VEGF-C表達(dá)抑制腫瘤血管和淋巴管生成,并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化,使腫瘤脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。HIF-1α基因沉默還顯著降低裸鼠移植瘤增殖活性和生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期,這表明HIF-1α基因沉默導(dǎo)致受HIF-1α調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)基因活性降低,使得處于靜止期的腫瘤細(xì)胞比例增高,腫瘤增殖活性降低,延遲了腫瘤的異質(zhì)性進(jìn)展過程,有利于荷瘤鼠生存期延長。此外,干擾組移植瘤新生脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常也會(huì)使其功能在一定程度上趨于正常,趨于正常化的脈管系統(tǒng)形成的微環(huán)境抑制了腫瘤細(xì)胞在乏氧環(huán)境下的異質(zhì)性克隆篩選,也會(huì)延緩腫瘤的異質(zhì)化進(jìn)程,也有利于荷瘤鼠生存期的延長。 4.HIF-1α沉默通過下調(diào)口腔癌CEACAM1和VEGF-C的表達(dá)抑制口腔癌血管和淋巴管生成,促進(jìn)新生血管和淋巴管結(jié)構(gòu)功能的正�；�,并能有效抑制腫瘤增殖活性和生長速度,延長荷瘤鼠生存期,因此,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能成為口腔癌治療中的有效聯(lián)合靶點(diǎn)。6國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)日(30572056)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.85
【圖文】：

圖1.HIF一la在癌旁正�？谇徊ぶ械捅磉_(dá)，胞核著色(A)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，胞核胞漿著色(B)。400x，DAB顯示表2.口腔鱗狀細(xì)胞癌cEAcAMI和HIF一1a表達(dá)與臨床資料的關(guān)系病例數(shù)CEACAM1HIF一la陰性陽性表達(dá)模式陽性陰911576胞膜胞漿86(95%)2650低中一高性別男63954654女28622422年齡三59歲36630232全60歲55946844腫瘤分期

圖2.cEACAMI在低分化口腔癌中呈胞漿表達(dá)(A)，在高分化癌中呈胞膜表達(dá)(B)在個(gè)別癌旁正�；砟[狀上皮棘細(xì)胞層以上呈胞膜表達(dá)(C)，浸潤到上皮內(nèi)的炎細(xì)胞也呈陽性表達(dá)。A，C640x，B，400x，DAB顯色圖3.CEACAMI陽性口腔癌中CEACAMI陽性脈管數(shù)量增多(A)，而CEACAMI陰性口腔癌中CEACAMI陽性脈管數(shù)量減少(B)。64Ox，DAB顯色

山東大學(xué)博士學(xué)位論文兮廠--.’萬.t.古“·~.‘幾.嗀棄?一入.似t’公心.:’t.二、、.一‘，;J.-試.，六，‘汀月、、、一赴沐:‘_氣’_‘.幾，嚴(yán):‘，譽(yù);歲圖2.cEACAMI在低分化口腔癌中呈胞漿表達(dá)(A)，在高分化癌中呈胞膜表達(dá)幾龍乞(B)在個(gè)別癌旁正�；砟[狀上皮棘細(xì)胞層以上呈胞膜表達(dá)(C)，浸潤到上皮內(nèi)的炎細(xì)胞也呈陽性表達(dá)。A，C640x，B，400x，DAB顯色

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳強(qiáng),楊述華,葉樹楠,王銳英;RNA干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α治療骨肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

本文編號(hào)：2797337