【摘要】：目的:成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma,AB)是一種牙源性腫瘤,發(fā)生于頜骨,其具有侵襲性生長和術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點。AB的臨床表現(xiàn)為生長緩慢的無痛性腫脹,鑒于疾病早期癥狀不明顯且缺乏有效治療措施,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。近年來研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)與腫瘤密切相關(guān),是腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的潛在靶標(biāo)。應(yīng)用生物信息學(xué)分析,篩選出在AB中差異性表達(dá)的miRNA-524及其相關(guān)靶點白細(xì)胞介素-33(interleukin,IL-33)。IL-33是白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)家族的成員,在多種類型的細(xì)胞中表達(dá)。細(xì)胞損傷或壞死時釋放出具有活性的成熟IL-33,激活免疫系統(tǒng)并提供了損傷信號。IL-33及其受體ST2和IL-1受體輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein,IL-1RAcP)形成IL-33/ST2信號通路。近年來研究表明,IL-33/ST2利用免疫調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等機(jī)制,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。因此,探討miRNA-524、IL-33和ST2在AB中的表達(dá)及臨床意義,為尋找AB的新治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:1、應(yīng)用Human miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù),篩選與AB相關(guān)的差異性表達(dá)的miRNA-524,采用莖環(huán)法實時定量PCR檢測在14例AB及正�？谇火つそM織(NOM)中的表達(dá)情況。2、應(yīng)用生物信息學(xué)方法尋找mi RNA-524的靶點IL-33,采用qRT-PCR檢測IL-33的mRNA和統(tǒng)計學(xué)分析初步驗證其兩者相關(guān)性。3、應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot在AB及正�？谇火つそM織中檢測IL-33和ST2的表達(dá)。4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色實驗方法,在90例AB蠟塊和20例NOM組織蠟塊中檢測IL-33和ST2的表達(dá)水平。結(jié)果:1、miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),實驗組(AB)miRNA表達(dá)量與對照組(NOM)比較后,其中變化在2.0倍以上,并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)的miRNA確定為差異表達(dá)的miRNA。miRNA-524在AB組織中比正常組織平均低8.96倍(P0.001),差異最明顯。綜合生物信息學(xué)分析等多重篩選條件,最終確定miRNA-524為下一步研究的miRNA分子,應(yīng)用莖環(huán)法實時定量PCR檢測miRNA-524在AB中的表達(dá)比NOM低8.19倍(P0.05)。2、應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miRNA-524與IL-33在AB中的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(r=-0.886,P0.05)。3、應(yīng)用qRT-PCR檢測IL-33表達(dá)高于NOM1.39倍(P0.05),ST2在AB中的表達(dá)是在NOM的1.76倍(P0.05);Western Blot檢測IL-33在AB中的表達(dá)高于NOM2.75倍(P0.05),ST2在AB中的表達(dá)是NOM的2.16倍(P0.05)。4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測IL-33在AB中的表達(dá)強(qiáng)度高于NOM,IL-33分布于腫瘤性上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中,間質(zhì)中炎性淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞陽性表達(dá),偶見單核細(xì)胞陽性染色,內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨周邊破骨細(xì)胞也見表達(dá);ST2在AB中的表達(dá)強(qiáng)度也是高于NOM的,ST2分布于腫瘤性上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中,間質(zhì)中炎性淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞陽性、單核細(xì)胞表達(dá),胞核偶見陽性染色,內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨周邊破骨細(xì)胞也見表達(dá)。結(jié)論:1、miRNA-524在AB中低表達(dá),IL-33可能是與miRNA-524關(guān)系密切的潛在靶點。2、與NOM相比,AB中IL-33和ST2的表達(dá)增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.81
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3. 實驗結(jié)果3.1 miRNA 芯片結(jié)果分析3.1.1 芯片信號分析我們選用的 miRNA 芯片是探針經(jīng)過 Tm 值均一化后的 LNA 增強(qiáng)探針，數(shù)據(jù)的可重復(fù)性達(dá)到 99%并且可探測到信號高達(dá) 10E+05 級，覆蓋所有在 miRBase18.0 中有注釋的的人，小鼠和大鼠的 miRNA，同時也包括和這些物種相關(guān)的病毒的 miRNA（圖 3.1）。miRNA 芯片信號結(jié)果如圖 3.2，證明芯片的可信度非常高。

2 miRNA 芯片結(jié)果分析圖。圖 A 為箱圖，通過背景消減及探針信號標(biāo)準(zhǔn)化后，組織樣本芯片的熒光信號強(qiáng)度一致，排除因信號不一致而導(dǎo)致的錯誤結(jié)果；圖 ，可以直觀地看到顯著性差異的 miRNAs，其中橫坐標(biāo)代表差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表標(biāo)記點代表有統(tǒng)計學(xué)意義的篩選出的 miRNAs，其中左邊紅色標(biāo)記點表示表達(dá)下As，右邊紅色標(biāo)記點代表上調(diào)的 miRNAs；圖 C 為散點圖，反應(yīng)了芯片間的重性越好越靠近對角線；圖 D 為聚類分析圖，x 軸為 12 個組織樣本（A1-A6 為 A6 為 NOM 組），y 軸為差異表達(dá)的 miRNAs，最上方為系統(tǒng)聚類分析，同一組別離較近，而不同組別之間差異最大。2 篩選差異表達(dá)的 miRNA我們將實驗組（AB）miRNA 表達(dá)量與對照組（NOM）比較后，其中在 2.0 倍以上，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）的 miRNA 確定為差 miRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn) miRNA-524 在 AB 中比 NOM 低約 10 倍，差異最

圖 3.3 TargetScanHuman7.1 預(yù)測 miRNA-524 與 IL-33 結(jié)合序列3.2 莖環(huán)實時定量 PCR 和實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測結(jié)果3.2.1 miRNA-524 的表達(dá)情況14 例 AB 標(biāo)本、14 例 NOM 標(biāo)本的 cDNA 經(jīng) Realtime PCR 擴(kuò)增獲得了miRNA-524 實時熒光 PCR 擴(kuò)增曲線（圖 3.4A）和溶解曲線（圖 3.4B）。通過軟件7500 Software v2.0.5分析出miRNA-524的CT值，為了校正不同標(biāo)本之間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，以 2- CT法表示相對定量結(jié)果，以 U6 作為內(nèi)參，2- CT表示實驗組目的基因相對于對照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異，即表示目的基因在 AB 和 NOM 之間的表達(dá)相對變化。結(jié)果如表 3.2 顯示：miRNA-524 在 AB中的表達(dá)相對于 NOM 低了 8.19 倍，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖 3.4C）。表 3.2 miRNA-524mRNA 在不同組織中的相對表達(dá)量差異倍數(shù)( X ±SD)組織名稱 樣本數(shù)（個） 相對表達(dá)量差異倍數(shù) P 值

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張成文;NF-κBp65及Phospho-NF-κBp65在人成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

本文編號：2795854