【摘要】：研究背景頭頸癌是全世界范圍內(nèi)第六大常見癌癥,上消化道的所有惡性腫瘤,從嘴唇的朱紅邊緣到食道的開始,都被稱為頭頸部癌癥;其中90%以上是鱗狀細(xì)胞癌,即頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinomas,HNSCC)。口腔癌占頭頸癌的絕大多數(shù),包括我國在內(nèi)的東亞-東南亞地區(qū)是全球范圍內(nèi)口腔癌發(fā)病率最高的地區(qū),且近十年來發(fā)病率并沒有明顯下降。其中口腔癌中超過90%的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌,即口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),其作為頭頸部鱗癌中最常見的類型,已經(jīng)引起人們極大程度上的重視。盡管手術(shù)、放化療及靶向治療等多學(xué)科單一治療或聯(lián)合治療策略在OSCC中的應(yīng)用在一定程度上取得了進(jìn)步,但近20年來患者的生存獲益改善有限,5年總生存率僅僅提高了 5%左右,與其他腫瘤相比差距顯著(如乳腺癌、前列腺癌等5年總生存率提高了約15-30%)�；赥NM分期的預(yù)后預(yù)測及治療方案選擇的指導(dǎo)性,是OSCC和其他許多實(shí)體腫瘤的主要預(yù)后預(yù)測模式,然而隨著腫瘤微環(huán)境特征的揭示,特別是腫瘤免疫微環(huán)境特征與腫瘤進(jìn)展,及其治療應(yīng)答與預(yù)后關(guān)系的發(fā)現(xiàn),證實(shí)了單一依賴TMN分期的癌癥預(yù)后預(yù)測的信息不完整性,也揭開了基于腫瘤微環(huán)境局部及其系統(tǒng)性免疫標(biāo)志物,評價(jià)預(yù)測癌癥預(yù)后的研究。尋找具有癌癥預(yù)后預(yù)測意義的免疫標(biāo)志,揭示癌癥局部免疫構(gòu)成特征及其意義與機(jī)制是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。原發(fā)性腫瘤是由癌細(xì)胞和其他許多其他非惡性細(xì)胞及非細(xì)胞成分組成。大量的研究已證明,腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)被與腫瘤相關(guān)且高度異質(zhì)性的髓系來源細(xì)胞浸潤,包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞(Tumor-associated dendritic cells,TADCs),腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(Tumor-associated neutrophils,TANs)及髓系來源的抑制細(xì)胞(myeloid cell-derived suppressorcells,MDSCs)。對這些炎性細(xì)胞群體與癌癥進(jìn)展及其治療應(yīng)答與預(yù)后關(guān)系的研究,已顯示出了重要的價(jià)值及意義。近年來,人們對中性粒細(xì)胞在癌癥生物學(xué)中的作用越來越感興趣,中性粒細(xì)胞在癌癥中的作用和重要性在過去十年中變得越來越明顯。中性粒細(xì)胞是人體抵御感染的第一道防線,對包括癌癥在內(nèi)的各種炎癥信號都可產(chǎn)生反應(yīng),已被用于中性粒細(xì)胞分類的術(shù)語包括N1/N2中性粒細(xì)胞,TANs及MDSCs。雖然有大量的研究證明,中性粒細(xì)胞在癌癥患者的外周血中積累,高循環(huán)的嗜中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值(Neutrophil lymphocyte ratio,NLR)是許多癌癥臨床預(yù)后差的一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物,但在OSCC中的研究數(shù)據(jù)較少,大隊(duì)列的研究數(shù)據(jù)對評價(jià)NLR在OSCC中的預(yù)測意義仍具有重要的意義。通常將腫瘤局部的中性粒細(xì)胞稱為TANs,目前公認(rèn)的表型為CD15+或CD66b+。中性粒細(xì)胞在炎癥和癌癥之間起著重要的聯(lián)系,不僅在腫瘤的進(jìn)展及治療應(yīng)答與預(yù)后也測中已顯示出重要意義。新進(jìn)對小鼠非小細(xì)胞肺鱗狀細(xì)胞癌模型的研究發(fā)現(xiàn),TANs在鱗癌的發(fā)生中起了重要的作用。還有研究表明TANs富集的腫瘤對TLR7激動劑、單獨(dú)或聯(lián)合PD-1阻斷劑易產(chǎn)生耐藥,采用吉西他濱耗竭CD11b+TANs可逆轉(zhuǎn)其耐藥。然而目前有關(guān)TANs的研究數(shù)據(jù)大多來自小鼠模型,有關(guān)人的研究數(shù)據(jù)尚少,因此,近年內(nèi)TANs也成為腫瘤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。近年來研究數(shù)據(jù)顯示HNSCC,尤其是OSCC的發(fā)病率呈上升趨勢,而人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)在OSCC中越來越多的被檢出,。在對HNSCC樣本的檢測證實(shí),HPV16和HPV18是主要的感染類型,而E7與宿主細(xì)胞的整合及其誘導(dǎo)的功能改變是導(dǎo)致其炎性微環(huán)境差異的主要因素之一。由此,HNSCC與HPV感染的關(guān)系及其對局部免疫環(huán)境與預(yù)后的影響,也成為近年來HNSCC治療研究中備受關(guān)注的內(nèi)容。已有研究顯示HPV陽性和HPV陰性的HNSCC在生物學(xué)特性、治療反應(yīng)和患者預(yù)后方面是兩種不同的實(shí)體瘤,如與HPV陰性的HNSCC相比,HPV 陽性患者的總體生存率明顯更好,對放療的敏感性好,其復(fù)發(fā)率也較低。對這種截然不同的生物學(xué)特性及其預(yù)后結(jié)果的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),HPV相關(guān)及非相關(guān)HNSCC的局部免疫環(huán)境差異可能是關(guān)鍵因素之一,如巨噬細(xì)胞的數(shù)量與類型等。這種腫瘤中差異免疫細(xì)胞浸潤對治療的成功來說非常重要。局部中性粒細(xì)胞浸潤反應(yīng)在顯微水平和分子水平上的腫瘤免疫微環(huán)境對了的炎性狀態(tài),而術(shù)前外周血中性粒與淋巴細(xì)胞比值(Neutrophil Lymphocyte rati o,NLR)反映了宿主整體炎性狀態(tài)。NLR現(xiàn)已被公認(rèn)為HNSCC的可靠預(yù)后標(biāo)志物,并可預(yù)測隱匿性轉(zhuǎn)移。但目前對OSCC患者中HPV的狀態(tài)與TANs及其循環(huán)中NLR之間的關(guān)系有何臨床意義的研究甚少。闡述人類OSCC患者HPV狀態(tài)及其與外周NLR及TANs的關(guān)系及其臨床意義,不僅為基于HPV的OSCC的分層,提高其精確預(yù)后預(yù)測模型提供新的數(shù)據(jù)依據(jù),也將為基于癌癥炎性環(huán)境差異的OSCC治療策略的精確設(shè)置提供新的依據(jù)。本項(xiàng)研究選取了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院81例OSCC患者為研究對象,采用了 P16組化染色(公認(rèn)的HPV感染標(biāo)志)及CD15染色(中性粒細(xì)胞標(biāo)志分子),分析了 HPV與TANs及循環(huán)NLR的關(guān)系及其與臨床預(yù)后的關(guān)系,并構(gòu)建了 HPV18-E7的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染OSCC,利用液相芯片等技術(shù)分析了 E7轉(zhuǎn)染對口腔癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,篩選HPV18-E7感染對OSCC組織中性粒細(xì)胞浸潤影響的關(guān)鍵差異因子,進(jìn)一步通過GEO數(shù)據(jù)庫及TCGA數(shù)據(jù)庫的分析,驗(yàn)證和探討了 HPV與中性粒細(xì)胞的關(guān)系對OSCC分層的意義,為解析TAN的浸潤機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。本項(xiàng)研究擬期為OSCC的精確分層及預(yù)后預(yù)測、個(gè)體化治療方案的制定提供新的依據(jù)與思路。第一部分口腔鱗狀細(xì)胞癌患者HPV表達(dá)和中性粒細(xì)胞的浸潤目的1.檢測CD15+中性粒細(xì)胞在OSCC中的浸潤情況及其對OSCC患者臨床病理特征的影響;2.分析OSCC中HPV表達(dá)狀態(tài)及其對OSCC患者臨床病理特征的影響;3.探究OSCC中CD15+中性粒細(xì)胞與HPV表達(dá)的相關(guān)性;4.分析CD15+中性粒細(xì)胞浸潤及HPV表達(dá)對OSCC患者預(yù)后的影響方法1.收集標(biāo)本及臨床病理資料:在本項(xiàng)研究中,回顧性將在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受過原發(fā)性和根治性切除術(shù)治療的OSCC患者共計(jì)81例納入隊(duì)列,將他們的基本信息并從病案系統(tǒng)中調(diào)取并進(jìn)行整合整理,同時(shí)運(yùn)用走訪和電話訪問等形式收集患者的信息,包括患者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤放療和化療情況。2.制作組織芯片并進(jìn)行免疫組化:使用免疫組化研究方法對OSCC組織標(biāo)本進(jìn)行處理,以檢測分析CD15+中性粒細(xì)胞和P16(HPV)在OSCC組織中的表達(dá)情況,探究其與OSCC患者臨床病理因素和預(yù)后的相關(guān)性。并通過數(shù)據(jù)分析,探討OSCC患者組織中,浸潤中性粒細(xì)胞的密度和HPV狀態(tài)的相關(guān)性。3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:對所納入的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier曲線的生存率分析,同時(shí)做數(shù)秩檢驗(yàn)。進(jìn)一步再進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的多變量分析,從而評估CD15+中性粒細(xì)胞浸潤情況、HPV感染狀態(tài)和患者生存期相關(guān)的預(yù)后因素。通過Spearman的rho系數(shù),探究CD15+中性粒細(xì)胞浸潤與HPV表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果表明,OSCC組織標(biāo)本中有大量的CD15+中性粒細(xì)胞浸潤,高密度CD15+中性粒細(xì)胞與較高的臨床分期(P0.001)、比較差的組織學(xué)分級(P0.001)、陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)等(P0.001)相關(guān),但是其與年齡、型別、吸煙史、飲酒史、腫瘤浸潤大小和術(shù)后放化療無明顯相關(guān)性。2.部分OSCC癌患者中感染HPV(P16)表達(dá)上調(diào),P16表達(dá)具有明顯的異質(zhì)性。HPV陰性狀態(tài)與較高的臨床分期(P=0.001)、比較差的組織學(xué)分級(P=0.002)、陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)、放療(P=0.038)等相關(guān),但是其與患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤浸潤大小和術(shù)后化療并沒有明顯相關(guān)性。3.根據(jù)免疫組化和數(shù)據(jù)檢驗(yàn)分析,檢測到CD15+中性粒細(xì)胞密度與HPV(P16)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P0.001)。也就是說,在HPV(P16)陽性表達(dá)組中性粒細(xì)胞浸潤密度較低,而在HPV(P16)陰性組中性粒細(xì)胞浸潤密度較高。4.生存率分析顯示,在整個(gè)數(shù)據(jù)中,不同的中性粒細(xì)胞浸潤程度和HPV表達(dá)類別之間的癌癥相關(guān)存活率有顯著差異。OSCC患者中,相對CD15+中性粒細(xì)胞低密度組,浸潤的CD15+中性粒細(xì)胞密度高的組預(yù)后較差。而與之相對應(yīng)的,相對HPV陰性表達(dá)組,HPV陽性表達(dá)組預(yù)后較好。此外,高密度CD15+中性粒細(xì)胞浸潤是口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P0.001)。結(jié)論1.OSCC中有豐富的中性粒細(xì)胞浸潤,HPV在OSCC中表達(dá)有明顯異質(zhì)性;在OSCC中,浸潤的中性粒細(xì)胞密度和HPV的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。2.OSCC患者中,浸潤的CD15+中性粒細(xì)胞密度高的組和HPV陰性表達(dá)組的預(yù)后較差,且高密度CD15+中性粒細(xì)胞和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是OSCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。意義OSCC是頭頸部癌癥的一種類型,而HPV在頭頸癌中被越來越多的發(fā)現(xiàn)。HPV在口腔和咽部的傳播途徑和持續(xù)性尚不清楚。然而,有很多跡象表明HPV通過性接觸傳播。HPV 陽性和HPV陰性的HNSCC在生物學(xué)特性、治療反應(yīng)和患者預(yù)后等方面是兩種截然不同的實(shí)體瘤;在腫瘤免疫細(xì)胞浸潤方面上,HPV 陽性和HPV陰性腫瘤之間存在著很大的差異。本項(xiàng)課題研究將OSCC定為具體研究對象,檢測分析CD 15+中性粒細(xì)胞在OSCC中的浸潤情況及HPV在OSCC中的表達(dá)情況,并且探究口腔鱗狀細(xì)胞癌中CD15+中性粒細(xì)胞與HPV表達(dá)的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)了 OSCC中,HPV的表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)這一現(xiàn)象。此現(xiàn)象結(jié)果的發(fā)現(xiàn),為HPV病毒感染所造成的特定腫瘤免疫微環(huán)境對HNSCC,尤其對OSCC產(chǎn)生預(yù)后影響的原因提供了新的論點(diǎn)和證據(jù),為進(jìn)一步地進(jìn)行相關(guān)可能機(jī)制研究提供了新的思路和啟發(fā)。第二部分口腔鱗狀細(xì)胞癌中HPV對中性粒細(xì)胞浸潤影響的可能機(jī)制研究目的探究OSCC細(xì)胞系中過表達(dá)HPV18-E7對中性粒細(xì)胞浸潤調(diào)控的可能機(jī)制。方法1.細(xì)胞培養(yǎng):將Cal-27細(xì)胞在37℃、5%二氧化碳的恒溫恒濕的規(guī)定培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),并采用其中含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液作為Cal-27細(xì)胞系的常規(guī)培養(yǎng)基。2.HPV18-E7質(zhì)粒的構(gòu)建:HPV18-E7-HA-Flag的全長cDNA序列購于美國Addgene公司,將目的基因插入在PCDNA3.1的框架上,此次質(zhì)粒的基礎(chǔ)構(gòu)建和進(jìn)一步包裝工作與上海博尚公司合作完成。目的質(zhì)粒命名為E7,空載質(zhì)粒命名為PC。3.Cal-27細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:對OSCC的Cal-27細(xì)胞分別進(jìn)行E7目的質(zhì)粒PC和空載質(zhì)粒的相關(guān)轉(zhuǎn)染,并設(shè)立空白對照組Control。分別在24及48小時(shí)后轉(zhuǎn)染完成時(shí),收集三組細(xì)胞的無細(xì)胞上清液,并同時(shí)提取他們的蛋白和RNA,并運(yùn)用western blot技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系進(jìn)行檢測,在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平探究HPV18-E7在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況,以此來檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。4.相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成后三組細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)的分析、增殖能力及凋亡水平檢測:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后,在光學(xué)顯微鏡下對三組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分析;對相關(guān)轉(zhuǎn)染完成后的三組細(xì)胞運(yùn)用MTT方法檢測它們增殖能力的變化及差異;對相關(guān)轉(zhuǎn)染完成后的三組細(xì)胞運(yùn)用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測其凋亡水平的變化及差異。5.細(xì)胞因子和趨化因子檢測:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,收集三組不同條件下培養(yǎng)的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的無細(xì)胞上清液,通過懸浮芯片技術(shù),進(jìn)行細(xì)胞因子和趨化因子的檢測分析。并通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測三組不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞上清液,驗(yàn)證分泌明顯差異的細(xì)胞因子或趨化因子在mRNA水平是否同樣分泌差異。6.免疫組化:通過免疫組化的方法檢測分析IL(CXCL8)在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況,探究并驗(yàn)證其與CD15+中性粒細(xì)胞和P16(HPV)在OSCC組織中的相關(guān)性。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:進(jìn)一步使用Spearman的Rho系數(shù)檢測方法探索在OSCC組織里中性粒細(xì)胞浸潤和HPV表達(dá)分別與IL-8表達(dá)的相關(guān)性。8.腫瘤基 因 組 圖 譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(http://cancergenome.nih.gov/)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)分析驗(yàn)證:在 GEO數(shù)據(jù)庫(GSE3292和GSE6791)和TCGA數(shù)據(jù)庫中共計(jì)500余例頭頸癌中,將標(biāo)記HPV狀態(tài)的數(shù)據(jù)提取并分析IL-8的差異表達(dá)情況,驗(yàn)證體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果1.成功構(gòu)建了 HPV18-E7-HA-Flag靶向質(zhì)粒DNA載體。2.成功將構(gòu)建好的靶向質(zhì)粒導(dǎo)入到Cal-27細(xì)胞中。通過qRT-PCR和Western Blot分析,發(fā)現(xiàn)HPV18-E7轉(zhuǎn)染組中,HPV18-E7基因在mRNA表達(dá)水平上和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上明顯高于PC空載質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染組和空白對照組。3.三組細(xì)胞的形態(tài)在使用光學(xué)顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)并沒有明顯差異,即HPV18-E7-HA-Flag對Cal-27細(xì)胞的形態(tài)方面沒有明顯影響;三組細(xì)胞增殖能力的變化被使用MTT方法進(jìn)行檢測分析,結(jié)果觀測到三組細(xì)胞增殖能力無明顯差異,即HPV18-E7-HA-Flag對Cal-27細(xì)胞的增殖能力無明顯影響;三組細(xì)胞的凋亡水平的變化應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測探索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞凋亡水平無明顯差異,即HPV18-E7-HA-Flag對Cal-27細(xì)胞的凋亡水平無明顯影響。4.液相懸浮芯片實(shí)驗(yàn)揭示:同對照組相比,HPV18-E7轉(zhuǎn)染組中的IL-8的表達(dá)下調(diào),而IL-1β,G-CSF及GM-CSF等其余多種細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)水平在三組細(xì)胞中并無明顯差異。并且IL-8的mRNA水平在HPV18-E7轉(zhuǎn)染組及對照組同樣存在的mRNA水平上的顯著差異,使用qRT-PCR技術(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。5.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)分析結(jié)果直觀分析得出,CXCL8(IL-8)在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。IL-8(CXCL8)表達(dá)與CD15+中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(P0.001),與HPV(P16)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P0.001)的結(jié)果也使用Spearman的Rho系數(shù)檢驗(yàn)的方法分析得出。6.在 GEO 數(shù)據(jù)庫(GSE3292 和 GSE6791)中發(fā)現(xiàn),CXCL8(IL-8)在 HPV 陰性組中的表達(dá)明顯上調(diào)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中共有約500例左右的頭頸鱗癌,但是標(biāo)記HPV狀態(tài)的共112例,其中HPV陰性80例,HPV 陽性32例。在這112例標(biāo)本數(shù)據(jù)中,同樣是CXCL8(IL-8)在HPV陰性組中的表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論1.HPV18-E7-HA-Flag靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以明顯提高Cal-27細(xì)胞中HPV18-E7-HA-Flag的表達(dá)水平。Cal-27細(xì)胞進(jìn)行HPV18-E7-HA-Flag靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,其形態(tài)學(xué)、增殖能力、凋亡水平無明顯差異。2.HPV18-E7陽性的OSCC細(xì)胞,可能通過下調(diào)IL-8的表達(dá)從而在一定程度上參與抑制中性粒細(xì)胞的浸潤。意義腫瘤微環(huán)境的本質(zhì)即相關(guān)的免疫炎性細(xì)胞及包括炎性因子在內(nèi)的相關(guān)非細(xì)胞成分在特定的微環(huán)境中聚集并相互作用。其中,髓系來源的相關(guān)細(xì)胞等在腫瘤從發(fā)生到發(fā)展轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程中都起著相當(dāng)重要的作用。實(shí)際上,免疫細(xì)胞可以直接清除腫瘤細(xì)胞或參與抗腫瘤反應(yīng)的誘導(dǎo),而腫瘤細(xì)胞則通過適當(dāng)?shù)挠?xùn)練招募并促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展。眾多參與其中的免疫細(xì)胞中包括中性粒細(xì)胞。我們選擇頭頸腫瘤中的典型類型,OSCC,從HPV所造成的特定腫瘤微環(huán)境入手,以中性粒細(xì)胞為切入點(diǎn),探究了致癌HPV過表達(dá)微環(huán)境對腫瘤中性粒細(xì)胞這個(gè)特殊細(xì)胞群體生物學(xué)行為的影響。發(fā)現(xiàn)在OSCC中,HPV或許通過下調(diào)中性粒細(xì)胞的趨化因子IL-8(CXCL8)的表達(dá)水平,抑制中性粒細(xì)胞的聚集,從而可能影響OSCC患者的預(yù)后結(jié)果。這為解析浸潤的中性粒細(xì)胞在HPV陽性的OSCC中比HPV陰性的OSCC中少的可能機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù);并對理解包含OSCC在內(nèi)的HNSCC生物學(xué)行為及腫瘤的轉(zhuǎn)歸意義重大,HPV和TAN作為癌癥的潛在靶點(diǎn),或許可以為HNSCC的新型的治療手段的開發(fā)提供新的思路提供助力。第三部分HPV狀態(tài)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者外周血NLR的相關(guān)性分析目的1.探索NLR是否可用于定義OSCC的高危類型;2.探究NLR與CD15+中性粒細(xì)胞、HPV的相關(guān)性;方法1.收集標(biāo)本及臨床病理資料:在本項(xiàng)課題研究中,回顧性納入在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院內(nèi),接受過原發(fā)性和根治性切除術(shù)治療的OSCC患者共計(jì)81例,將他們的信息從醫(yī)院病案系統(tǒng)中調(diào)取,同時(shí)進(jìn)行走訪或者電話訪問等形式收集將患者基本信息搜集整合,并這些收集到的信息計(jì)算得出NLR。2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:NLR的最佳臨界值使用了 ROC曲線分析和You den's指數(shù)公式計(jì)算方法得出,并通過此臨界值將NLR分為兩類,進(jìn)一步進(jìn)行運(yùn)算分析。Kaplan-Meier曲線是進(jìn)行生存分析的具體方法,計(jì)算后再進(jìn)行對數(shù)秩檢驗(yàn)。NLR分別與中性粒細(xì)胞浸及與HPV表達(dá)的相關(guān)性都采用了 Spearman的Rho系數(shù)檢測方法進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果1.通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),OSCC中,根據(jù)使用ROC曲線分析和You den's指數(shù)(敏感性+特異性-1)確定的最佳臨界值,對NLR分為兩類進(jìn)行分析:NLR≤2.925 vs NLR2.925。。2.對81例OSCC患者的臨床基本信息檢測分析后得出,NLR2.925可提示OSCC患者具有較差的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival,DFS)。3.根據(jù)免疫組化和數(shù)據(jù)檢驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)CD15+中性粒細(xì)胞在OSCC組織中局部浸潤密度高的組,NLR較高;CD15+中性粒細(xì)胞在OSCC組織中局部浸潤密度低組,NLR較低。而HPV為陽性時(shí),患者的NLR較低;HPV為陰性狀態(tài)時(shí),患者的NLR則較高。在OSCC組織中浸潤的CD15+中性粒細(xì)胞密度與患者術(shù)前外周血中NLR呈正相關(guān),而HPV狀態(tài)則與NLR呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.在口 OSCC中與NLR≤2.925相比,NLR2.925與患者較差的DFS和OS明顯相關(guān)。2.OSCC中,局部浸潤的CD15+中性粒細(xì)胞密度與NLR呈正相關(guān)。3.OSCC患者的致癌HPV的感染與患者整體炎性狀態(tài)中NLR呈負(fù)相關(guān)。意義全身和局部炎癥反應(yīng)中,“短命”的中性粒細(xì)胞都起著重要作用。有研究報(bào)道中性粒細(xì)胞的上調(diào)可以反映癌細(xì)胞的侵襲性特征,這主要是由腫瘤細(xì)胞的造血細(xì)胞因子刺激而引起的。精氨酸酶、活性氧、一氧化氮等物質(zhì)都可以由中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生,這些物質(zhì)可以抑制細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的功能,同時(shí),在宿主中淋巴細(xì)胞主要可以通過抑制腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移從而具有抗癌的活性。通過中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的相結(jié)合計(jì)算得出的反映宿主炎性狀態(tài)的整體指標(biāo),高NLR水平在先前的許多研究中已經(jīng)被證明是癌癥患者預(yù)后不良的一個(gè)有希望的新興指標(biāo)。我們通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證,HPV或許通過下調(diào)IL-8的表達(dá)抑制局部了腫瘤組織里中性粒細(xì)胞的聚集或浸潤,從而改變了特定腫瘤微環(huán)境中的局部炎性狀態(tài)。在此,我們又將NLR這個(gè)參數(shù)加入到研究中,分析得到OSCC患者的致癌HPV的感染與患者整體炎性狀態(tài)中NLR呈負(fù)相關(guān)。本項(xiàng)研究不僅從顯微炎性水平探討了局部中性粒細(xì)胞浸潤與HPV狀態(tài)的相關(guān)性及它們分別對OSCC患者臨床病理特征的影響,還將患者整體炎性的指標(biāo)之一 NLR納入研究,為HNSCC及OSCC的治療風(fēng)險(xiǎn)的評估、療效的預(yù)測以及精準(zhǔn)的個(gè)體方案制定提供新的思路及相關(guān)可能依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8
【圖文】：

圖１．邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞和ＨＰＶ在ＯＳＣＣ患者組織中的浸潤及表達(dá)情況逡逑Ａ：邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤于ＯＳＣＣ患者組織中（黑色箭頭所指）（ａ）。在腫逡逑瘤組織中，中性粒細(xì)胞主要分布于腫瘤間質(zhì)（ｂ）、癌巢（ｃ）、及邊緣區(qū)域逡逑（ｄ）中。（ａ：１０0ｘ；ｂ，ｃ，邋ｄ：４０0ｘ）逡逑Ｂ：在邋ＯＳＣＣ邋組織中，ＨＰＶ邋表達(dá)明顯（ｂ）。（ａ：１００ｘ；ｂ：４００ｘ）逡逑Ｃ：邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤和ＨＰＶ表達(dá)之間的關(guān)系，ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤和逡逑ＨＰＶ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。ＨＰＶ陰性表達(dá)的腫瘤組織樣本中，浸潤的中性粒細(xì)胞逡逑較多（ａ），而ＨＰＶ陽性表達(dá)的腫瘤組織樣本中，浸潤的中性粒細(xì)胞較少逡逑（ｂ）。（ａ，ｂ：４０0ｘ）逡逑Ａ邋邐邐邋Ｂ邋邐逡逑１０－邋—Ｉ邋，邐Ｐ＜０．００１邐？０－邋一－ｎ＝ｒ－邐－Ｊ邐Ｐ－０．００７逡逑Ｉ邐ｌ；邐Ｉ邐、逡逑°－

？．．．逡逑ｃ邐ｄ邋．邐．邋Ｃ邋ａ邐．邋ｂ逡逑■邋＇邋．．．．邋．逡逑＇邋？邋■邋■逡逑．、邋１邋．．邋＇逡逑圖１．邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞和ＨＰＶ在ＯＳＣＣ患者組織中的浸潤及表達(dá)情況逡逑Ａ：邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤于ＯＳＣＣ患者組織中（黑色箭頭所指）（ａ）。在腫逡逑瘤組織中，中性粒細(xì)胞主要分布于腫瘤間質(zhì)（ｂ）、癌巢（ｃ）、及邊緣區(qū)域逡逑（ｄ）中。（ａ：１０0ｘ；ｂ，ｃ，邋ｄ：４０0ｘ）逡逑Ｂ：在邋ＯＳＣＣ邋組織中，ＨＰＶ邋表達(dá)明顯（ｂ）。（ａ：１００ｘ；ｂ：４００ｘ）逡逑Ｃ：邋ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤和ＨＰＶ表達(dá)之間的關(guān)系，ＣＤ１５＋中性粒細(xì)胞浸潤和逡逑ＨＰＶ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。ＨＰＶ陰性表達(dá)的腫瘤組織樣本中，浸潤的中性粒細(xì)胞逡逑較多（ａ），而ＨＰＶ陽性表達(dá)的腫瘤組織樣本中，浸潤的中性粒細(xì)胞較少逡逑（ｂ）。（ａ，ｂ：４０0ｘ）逡逑Ａ邐邐Ｂ邋邐逡逑

圖３．邋ＨＰＶ過表達(dá)質(zhì)粒向Ｃａｌ－２７細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證逡逑Ａ：邋ＨＰＶ１８－Ｅ７－Ｈａ－Ｆｌａｇ目的質(zhì)粒ＤＮＡ載體轉(zhuǎn)染的ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果。結(jié)果表明，逡逑ＨＰＶ１８－Ｅ７－Ｈａ－Ｆｌａｇ目的質(zhì)粒ＤＮＡ載體轉(zhuǎn)染組的Ｅ７基因ｍＲＮＡ水平的表達(dá)明逡逑顯高于其他兩組。逡逑Ｂ、Ｃ：邋ＨＰＶ１８－Ｅ７－Ｈａ－Ｆｌａｇ目的質(zhì)粒ＤＮＡ載體轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。結(jié)果表逡逑明，ＨＰＶ１８－Ｅ７－Ｈａ－Ｆｌａｇ目的質(zhì)粒ＤＮＡ載體轉(zhuǎn)染組的Ｅ７基因蛋白水平的表達(dá)明逡逑顯高于其他兩組。（＊戶＜0．0５，邋＊＊Ｐ＜0．0ｌ邋）逡逑ＡＢＣ逡逑

本文編號：2794735