【摘要】：目的： 結(jié)合上皮的根方遷移以及牙周韌帶膠原纖維的降解導(dǎo)致牙周袋的形成是慢性牙周炎形成的主要特征之一。近年研究表明,在病理狀態(tài)下,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase MMPs)合成分泌增加,活性增強,導(dǎo)致牙周韌帶、牙槽骨內(nèi)的膠原纖維降解。因此,MMPs在牙周病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。牙周炎、合創(chuàng)傷與吸煙都可以造成局部牙周組織的乏氧。乏氧環(huán)境對組織細胞有著重要的生物學(xué)影響,那么,乏氧是否影響該細胞對在牙周病時牙周組織破壞密切相關(guān)的MMPs/TIMPs的分泌從而在牙周病的病程中發(fā)揮重要作用,目前尚不清楚。因此本實驗旨在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)牙周膜細胞,模擬相當(dāng)于牙周膜組織局部缺血的病理模型,探討乏氧對牙周韌帶成纖維細胞MMPs mRNA表達的影響,這將對缺氧狀態(tài)下的牙周炎病理發(fā)病過程以及治療方法的選擇具有重要意義。 方法： 1.人牙周韌帶成纖維細胞的分離培養(yǎng)及鑒定選取山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診就診的10～20患者,向患者及家屬說明用途并征得同意后,搜集無齲壞、牙周組織健康的前磨牙,牙根已發(fā)育完成。牙齒拔除后立即放入含有雙抗的D-Hank液中保存。轉(zhuǎn)運到事先消毒好的超凈臺內(nèi),經(jīng)瓶內(nèi)牙齒用含有雙抗的D-Hank液充分沖洗三次,無菌條件下用手術(shù)刀刮取牙根中下部分的牙周膜組織,采用組織塊法進行人牙周韌帶細胞的原代培養(yǎng),細胞增殖達培養(yǎng)瓶面積的90%后細胞傳代,第3代細胞用于細胞來源鑒定,第5代細胞用于實驗。ABC法免疫組化染色鑒定人牙周韌帶成纖維細胞的來源。 2.實驗分組常氧組(對照組)：人牙周韌帶成纖維細胞在20%O2、5%CO2、75%N2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；乏氧組：牙周膜細胞分三組在1%O2、5%CO2、94%N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h,24h和48h。 3.RT-PCR檢測人牙周韌帶成纖維細胞MMPs和TIMPs的表達將生長狀況良好的第5代細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,在乏氧和常氧條件下培養(yǎng)。在12h,24h,48h各取一塊6孔板,每個培養(yǎng)皿的細胞加2ml PBS沖洗2次,棄掉沖洗液。每個培養(yǎng)孔加入1mlTrizol,吹打,收集裂解液,-80℃低溫保存,備用。Trizol兩步法分別提取細胞總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測MMP-1,MMP-2,MMP-9,MMP-13,TIMP-1, TIMP-2的基因表達情況,并用軟件進行半定量分析。 結(jié)果：1.乏氧12h,24h,48h人牙周韌帶成纖維細胞MMP-2,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表達高于對照組；乏氧48h MMP-1mRNA的表達高于對照組。2.乏氧組MMP-2mRNA的表達呈明顯遞增趨勢,與對照組相比差異具有顯著性(P0.01)。3.乏氧12h組MMP-1mRNA表達有一過性降低,隨著乏氧時間延長,其表達增加。乏氧12h組與常氧組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4.乏氧12h組TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA表達有一過性升高,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨著乏氧時間延長,其表達與對照組相比增加不明顯。乏氧組內(nèi)TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA的表達呈遞減趨勢。5.實驗中未檢測到MMP-9,13mRNA的表達,結(jié)果未顯示。6.乏氧48h后MMP-1/TIMP-1mRNA的比值變化較常氧組不明顯,但乏氧12h組MMP-1/TIMP-1mRNA的比值明顯降低,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。乏氧組組內(nèi)MMP-1/TIMP-1mRNA的比值變化顯著,表達呈明顯遞增趨勢。7.乏氧12h,24h,48h組MMP-2/TIMP-2mRNA的比值較常氧組明顯上升,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：乏氧可以導(dǎo)致MMP-1,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2的表達,并使MMP-2/TIMP-2的表達失衡,推測MMP-2/TIMP-2表達失衡途徑可能是乏氧導(dǎo)致牙周炎時牙周組織破壞加重的機制之一
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

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本文編號：2793813