【摘要】：口腔癌是最常見的十大惡性腫瘤之一,而在我國口腔癌中,舌癌的發(fā)病率居第一位。舌癌生長快,惡性程度高,浸潤性較強(qiáng)。治療方法常是手術(shù)、放療、化療等的綜合治療,但患者的五年生存率仍然很低,探尋積極有效的預(yù)防途徑及有效的治療藥物顯得十分迫切和必要。 熊果酸對多種致癌、促癌物有抵抗作用。體外實驗證實其可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡。而熊果酸對口腔腫瘤的作用研究較少,而其對舌癌作用機(jī)制的研究,國內(nèi)外尚不多見。 采用體外培養(yǎng)人舌癌Tca8113細(xì)胞的方法,觀察熊果酸對其產(chǎn)生的作用。在此基礎(chǔ)上,采用MTT法,流式細(xì)胞術(shù)、電鏡觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、及RT-PCR、Western Blot等多種分子生物學(xué)技術(shù)觀察熊果酸對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響并探討其發(fā)生機(jī)制。在體外實驗的基礎(chǔ)上,以Tca8113細(xì)胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,應(yīng)用適當(dāng)濃度的熊果酸進(jìn)行治療,觀察熊果酸經(jīng)體內(nèi)代謝后對腫瘤的影響以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng),并探討其發(fā)生機(jī)制,為舌癌的治療尋找新的藥物,拓展新的思路和方法,為熊果酸在口腔癌治療中的開發(fā)、應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本研究分為以下三個部分： 第一部分熊果酸對人舌癌Tca8113細(xì)胞增殖的影響及促凋亡作用 方法 1.光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)和經(jīng)熊果酸作用的Tca8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。 2.經(jīng)濃度為6.25、12.5、25、50μmol/L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞,分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl terazolium, MTT)比色法,檢測Tca8113細(xì)胞增殖活性的改變,觀察不同濃度熊果酸作用不同時間后對人舌癌Tca8113的毒性效應(yīng)。 3.將濃度25μmol/L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞,分別培養(yǎng)0、24、48、72h后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMeter, FCM)在功能水平上檢測人舌癌Tca8113細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期分布情況。 4.應(yīng)用透射電鏡觀察經(jīng)25μmol/L熊果酸作用72h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 5.統(tǒng)計學(xué)處理：采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。MTT法檢測結(jié)果采用兩因素方差分析,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果采用單因素方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果 1.經(jīng)熊果酸作用后的Tca8113細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。 2.熊果酸對Tca8113細(xì)胞有明顯的生長抑制作用,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性；不同濃度組間、不同時間組間生長抑制率均有顯著性差異(p0.01)。50μmol/L熊果酸作用72h后細(xì)胞生長抑制率達(dá)68.80%。 3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,隨熊果酸作用時間延長,Tca8113細(xì)胞凋亡率由2.57%增加至24.51%,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯(p0.05),而S期細(xì)胞比例逐漸降低(p0.01),G0/G1期細(xì)胞比率明顯升高(p0.01)。 4.透射電鏡顯示熊果酸作用后,細(xì)胞骨架破壞,核染色質(zhì)濃縮成塊,同時可見凋亡小體。 第二部分熊果酸促人舌癌Tca8113.細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制 方法 1.分別制作經(jīng)濃度25μmol/L熊果酸作用0、24、48、72h的細(xì)胞爬片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax基因蛋白表達(dá)情況。 2.將25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞0、24、48、72h后,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)檢測藥物作用后的Tca8113細(xì)胞中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表達(dá)情況,并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細(xì)胞增殖及其促其凋亡的機(jī)制。 3.將25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法檢測藥物作用后的Tca8113細(xì)胞中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表達(dá)情況,并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析,進(jìn)一步研究熊果酸抑制舌癌細(xì)胞增殖及其促其凋亡的機(jī)制。 4.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果 1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：NF-κB棕黃色著色在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)；VEGF棕黃色著色在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；Bc1-2、Bax棕黃色顆粒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 2. RT-PCR結(jié)果：經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細(xì)胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因mRNA表達(dá)逐漸降低,Bax細(xì)胞因子mRNA表達(dá)逐漸升高,Bc1-2/Bax比例降低,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 3. Western blot檢測結(jié)果：經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細(xì)胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因蛋白表達(dá)逐漸降低,Bax蛋白表達(dá)逐漸升高,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 第三部分熊果酸治療荷瘤裸鼠的體內(nèi)實驗研究 方法 1.選用4-6w齡的BALB/C-nu/nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接種Tca8113細(xì)胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機(jī)分為對照組和實驗組,每組6只,實驗組每d向腫瘤組織局部注射熊果酸,劑量為0.05mg/g體質(zhì)量；對照組注射同體積PBS(0.01M,pH7.4)。共治療4w。 2.每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動狀況。每w測量瘤體大小及裸鼠體重,進(jìn)行藥物毒性評價。 3.治療結(jié)束時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。 4.光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織及腦、心、肝、脾、腎等重要臟器。 5.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表達(dá)情況,并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細(xì)胞移植瘤機(jī)制。 6.采用Western Blot方法檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表達(dá)情況,并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析,進(jìn)一步研究熊果酸抑制舌癌細(xì)胞移植瘤增殖及其促其凋亡的機(jī)制。 7.采用TUNEL法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況,統(tǒng)計細(xì)胞凋亡指數(shù)。 8.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。裸鼠體質(zhì)量變化及瘤體質(zhì)量變化分別采用獨立樣本的t檢驗和配對t檢驗。RT-PCR及Western Blot采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果 1.與對照組相比,實驗組腫瘤生長緩慢,隨注射熊果酸時間增長,腫瘤被抑制效果更加明顯。到治療結(jié)束時,兩組裸鼠移植瘤體積、瘤質(zhì)量均存在顯著性差異(p0.05)。瘤質(zhì)量及瘤體積抑制率達(dá)到55.65%和61.72%。 2.治療過程中,裸鼠未見明顯不良反應(yīng),治療結(jié)束時,各組裸鼠體質(zhì)量與治療前體質(zhì)量相比增加平穩(wěn),比值大于0.8,未見明顯毒性反應(yīng)。兩組裸鼠的重要臟器腦、心、肝、脾、腎等均未見器質(zhì)性改變及瘤轉(zhuǎn)移等。 3.光學(xué)顯微鏡下,實驗組腫瘤內(nèi)組織壞死崩解的面積明顯大于對照組,細(xì)胞形態(tài)的異形性比對照組小,可見核固縮等凋亡現(xiàn)象。 4. RT-PCR技術(shù)檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),Bax mRNA表達(dá)上調(diào),有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 5. Western Blot方法檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下調(diào),Bax基因蛋白表達(dá)上調(diào),有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 6.與對照組相比,實驗組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞明顯增多,兩組AI分別為：1.63±0.30,17.39±2.78,組間有顯著性差異(p0.05)。 結(jié)論 本研究前兩部分采用MTT方法、流式細(xì)胞術(shù)及電鏡技術(shù)檢測熊果酸對人舌癌Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、RT-PCR技術(shù)以及Western Blot免疫印跡等分子生物學(xué)技術(shù)檢測了熊果酸對人舌癌Tca8113細(xì)胞基因NF-κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)的影響。第三部分采用上述部分方法進(jìn)行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的檢測,得出如下結(jié)論： 1.熊果酸對人舌癌Tca8113細(xì)胞具有增殖抑制作用,并且呈時間劑量依賴性。 2.熊果酸對人舌癌Tca8113細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,并且存在時間依賴性。 3.熊果酸能下調(diào)人舌癌Tca8113細(xì)胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2 mRNA以及蛋白表達(dá),能上調(diào)Bax表達(dá),改變了Bc1-2/Bax的比例,且具有時間依賴性。此作用可能是其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。 4.熊果酸參與Tca8113細(xì)胞周期調(diào)控,使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。熊果酸對細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及相關(guān)基因的抑制作用可能均與其G0/G1期阻滯有關(guān)。 5.成功構(gòu)建了人舌癌Tca8113細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,證實熊果酸能抑制舌癌移植瘤生長,且對機(jī)體無明顯毒、副作用。 6.與體外實驗結(jié)果相似,熊果酸能下調(diào)舌癌裸鼠移植瘤NF-κB、VEGF、Bc1-2 mRNA以及蛋白表達(dá),上調(diào)Bax mRNA及蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制移植瘤生長。本研究為熊果酸的臨床應(yīng)用提供一定的參考資料。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.8
【圖文】：

中芄鉿岫勻松喟?Tcas113細(xì)胞增殖的影響及促凋亡作用用時間延長、濃度升高，抑制程度增加(見表1一1，圖1一1)。其中25四o1/L濃度組已具有較強(qiáng)抑制作用，48小時將近達(dá)到半數(shù)抑制率。因此，本研究其他相關(guān)實驗均選用 25omol/L濃度的熊果酸用作實驗。3.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化流式細(xì)胞雙標(biāo)檢測顯示，熊果酸作用0h(對照組)、24、48、72h可見凋亡逐漸增加。其凋亡比例(見表1一2，圖1一2一1一3)，隨藥物作用時間延長，出現(xiàn)少數(shù)壞死細(xì)胞。電鏡下可見熊果酸作用后腫瘤細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞質(zhì)充滿了空泡。流式細(xì)胞檢查細(xì)胞周期顯示，25omol/L熊果酸作用0h(對照組)、24、48、72h可見

治療結(jié)束時，兩組裸鼠瘤質(zhì)量有顯著性差異(t=23.327汗代0.01)。體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率分別達(dá)61.72%和55.65%(Z人(0.01)。表明熊果酸能有效抑制舌癌移植瘤的生長(見表3一1一3一2;圖3一1，3一2;照片3一1)。熊果酸毒性評價:整個治療過程中，裸鼠精神狀態(tài)可，生長發(fā)育、飲食、活動均未見明顯異常，表明熊果酸毒性反應(yīng)小。治療結(jié)束時兩組裸鼠體重未見明顯差異(見表3一3)。

llllllllllllllllllllll尸尸.~一-，....1--匕匕圖3一1不同治療時間腫瘤體積比較Fig3一 1ComparisonoftumorvolumatvarianttimePointsaftertreatment表3一2治療前后各組裸鼠體質(zhì)量變化(Table3一 2Bodymassehangesofthenudemieein beforeandafterthetreatment萬士s，n=6) twogrouPsbetween組別治療前體質(zhì)褚_(g)治療后體質(zhì)址(g)對照組19.7;1土 1.262567士1.12實驗織19.58士1.2飛25.87土1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張奕穎;鄧濤;胡志芳;張秋萍;張靜;江華;;熊果酸抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J];癌癥;2006年04期

2 馮元勇;李寧毅;陳萬濤;;人口腔癌細(xì)胞系的建立[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年01期

3 劉瓊;葉秀峰;張徽;;熊果酸抑制膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長及其機(jī)制的初步探討[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年11期

4 趙清;魏盟;趙炳輝;何怡青;劉一文;;熊果酸對兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響[J];世界臨床藥物;2006年12期

5 樊明文,王茜,邊專,范兵;熊果酸對人舌鱗癌細(xì)胞株TSCCa的抑制作用及其機(jī)制探討[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2004年01期

6 王穎,耿偉,譚潔,沈志祥;熊果酸對結(jié)腸癌細(xì)胞作用機(jī)制的初步研究[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年04期

7 雒廷亮,張景偉,曹文豪,羅娜,劉國際;山茱萸中熊果酸提取工藝研究進(jìn)展[J];河南化工;2005年02期

8 戴穎;朱萱;;熊果酸抗實驗性大鼠肝纖維化作用機(jī)制的研究[J];江西醫(yī)藥;2008年05期

9 王開;朱炎;劉玲珍;康非吾;;凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax與舌鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性研究[J];口腔醫(yī)學(xué);2009年07期

10 王琳琳;邵樂南;陳衛(wèi)民;;STAT3和VEGF在涎腺腫瘤中的表達(dá)及意義[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年06期

本文編號：2793720