【摘要】：口腔癌是最常見的十大惡性腫瘤之一,而在我國口腔癌中,舌癌的發(fā)病率居第一位。舌癌生長快,惡性程度高,浸潤性較強。治療方法常是手術、放療、化療等的綜合治療,但患者的五年生存率仍然很低,探尋積極有效的預防途徑及有效的治療藥物顯得十分迫切和必要。 熊果酸對多種致癌、促癌物有抵抗作用。體外實驗證實其可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡。而熊果酸對口腔腫瘤的作用研究較少,而其對舌癌作用機制的研究,國內外尚不多見。 采用體外培養(yǎng)人舌癌Tca8113細胞的方法,觀察熊果酸對其產生的作用。在此基礎上,采用MTT法,流式細胞術、電鏡觀察、免疫細胞化學技術、及RT-PCR、Western Blot等多種分子生物學技術觀察熊果酸對Tca8113細胞增殖、凋亡的影響并探討其發(fā)生機制。在體外實驗的基礎上,以Tca8113細胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,應用適當濃度的熊果酸進行治療,觀察熊果酸經體內代謝后對腫瘤的影響以及荷瘤裸鼠的毒性反應,并探討其發(fā)生機制,為舌癌的治療尋找新的藥物,拓展新的思路和方法,為熊果酸在口腔癌治療中的開發(fā)、應用提供實驗依據(jù)。本研究分為以下三個部分： 第一部分熊果酸對人舌癌Tca8113細胞增殖的影響及促凋亡作用 方法 1.光學顯微鏡觀察未經和經熊果酸作用的Tca8113細胞的形態(tài)學變化。 2.經濃度為6.25、12.5、25、50μmol/L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細胞,分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl terazolium, MTT)比色法,檢測Tca8113細胞增殖活性的改變,觀察不同濃度熊果酸作用不同時間后對人舌癌Tca8113的毒性效應。 3.將濃度25μmol/L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細胞,分別培養(yǎng)0、24、48、72h后,應用流式細胞術(Flow CytoMeter, FCM)在功能水平上檢測人舌癌Tca8113細胞的凋亡率及細胞周期分布情況。 4.應用透射電鏡觀察經25μmol/L熊果酸作用72h的細胞超微結構變化 5.統(tǒng)計學處理：采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。MTT法檢測結果采用兩因素方差分析,流式細胞術結果采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。 結果 1.經熊果酸作用后的Tca8113細胞發(fā)生了形態(tài)學變化。 2.熊果酸對Tca8113細胞有明顯的生長抑制作用,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性；不同濃度組間、不同時間組間生長抑制率均有顯著性差異(p0.01)。50μmol/L熊果酸作用72h后細胞生長抑制率達68.80%。 3.流式細胞術結果顯示,隨熊果酸作用時間延長,Tca8113細胞凋亡率由2.57%增加至24.51%,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。G2/M期細胞比例變化不明顯(p0.05),而S期細胞比例逐漸降低(p0.01),G0/G1期細胞比率明顯升高(p0.01)。 4.透射電鏡顯示熊果酸作用后,細胞骨架破壞,核染色質濃縮成塊,同時可見凋亡小體。 第二部分熊果酸促人舌癌Tca8113.細胞凋亡的作用機制 方法 1.分別制作經濃度25μmol/L熊果酸作用0、24、48、72h的細胞爬片,采用免疫細胞化學技術檢測細胞NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax基因蛋白表達情況。 2.將25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細胞0、24、48、72h后,應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術檢測藥物作用后的Tca8113細胞中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表達情況,并對檢測結果進行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細胞增殖及其促其凋亡的機制。 3.將25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法檢測藥物作用后的Tca8113細胞中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表達情況,并對檢測結果進行半定量分析,進一步研究熊果酸抑制舌癌細胞增殖及其促其凋亡的機制。 4.統(tǒng)計學處理：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。 結果 1.免疫細胞化學染色結果：NF-κB棕黃色著色在細胞核和細胞漿內；VEGF棕黃色著色在細胞質內；Bc1-2、Bax棕黃色顆粒在細胞質內。 2. RT-PCR結果：經熊果酸作用后,Tca8113細胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因mRNA表達逐漸降低,Bax細胞因子mRNA表達逐漸升高,Bc1-2/Bax比例降低,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 3. Western blot檢測結果：經熊果酸作用后,Tca8113細胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因蛋白表達逐漸降低,Bax蛋白表達逐漸升高,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 第三部分熊果酸治療荷瘤裸鼠的體內實驗研究 方法 1.選用4-6w齡的BALB/C-nu/nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接種Tca8113細胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機分為對照組和實驗組,每組6只,實驗組每d向腫瘤組織局部注射熊果酸,劑量為0.05mg/g體質量；對照組注射同體積PBS(0.01M,pH7.4)。共治療4w。 2.每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動狀況。每w測量瘤體大小及裸鼠體重,進行藥物毒性評價。 3.治療結束時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。 4.光學顯微鏡下觀察腫瘤組織及腦、心、肝、脾、腎等重要臟器。 5.應用RT-PCR技術檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表達情況,并對檢測結果進行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細胞移植瘤機制。 6.采用Western Blot方法檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表達情況,并對檢測結果進行半定量分析,進一步研究熊果酸抑制舌癌細胞移植瘤增殖及其促其凋亡的機制。 7.采用TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)。 8.統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。裸鼠體質量變化及瘤體質量變化分別采用獨立樣本的t檢驗和配對t檢驗。RT-PCR及Western Blot采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。 結果 1.與對照組相比,實驗組腫瘤生長緩慢,隨注射熊果酸時間增長,腫瘤被抑制效果更加明顯。到治療結束時,兩組裸鼠移植瘤體積、瘤質量均存在顯著性差異(p0.05)。瘤質量及瘤體積抑制率達到55.65%和61.72%。 2.治療過程中,裸鼠未見明顯不良反應,治療結束時,各組裸鼠體質量與治療前體質量相比增加平穩(wěn),比值大于0.8,未見明顯毒性反應。兩組裸鼠的重要臟器腦、心、肝、脾、腎等均未見器質性改變及瘤轉移等。 3.光學顯微鏡下,實驗組腫瘤內組織壞死崩解的面積明顯大于對照組,細胞形態(tài)的異形性比對照組小,可見核固縮等凋亡現(xiàn)象。 4. RT-PCR技術檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、bcl-2 mRNA表達下調,Bax mRNA表達上調,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 5. Western Blot方法檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下調,Bax基因蛋白表達上調,有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 6.與對照組相比,實驗組腫瘤組織中凋亡細胞明顯增多,兩組AI分別為：1.63±0.30,17.39±2.78,組間有顯著性差異(p0.05)。 結論 本研究前兩部分采用MTT方法、流式細胞術及電鏡技術檢測熊果酸對人舌癌Tca8113細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響,采用免疫細胞化學技術、RT-PCR技術以及Western Blot免疫印跡等分子生物學技術檢測了熊果酸對人舌癌Tca8113細胞基因NF-κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達的影響。第三部分采用上述部分方法進行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的檢測,得出如下結論： 1.熊果酸對人舌癌Tca8113細胞具有增殖抑制作用,并且呈時間劑量依賴性。 2.熊果酸對人舌癌Tca8113細胞具有誘導凋亡作用,并且存在時間依賴性。 3.熊果酸能下調人舌癌Tca8113細胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2 mRNA以及蛋白表達,能上調Bax表達,改變了Bc1-2/Bax的比例,且具有時間依賴性。此作用可能是其抑制細胞增殖的機制之一。 4.熊果酸參與Tca8113細胞周期調控,使細胞阻滯于G0/G1期。熊果酸對細胞的增殖抑制、誘導凋亡及相關基因的抑制作用可能均與其G0/G1期阻滯有關。 5.成功構建了人舌癌Tca8113細胞裸鼠移植瘤模型,證實熊果酸能抑制舌癌移植瘤生長,且對機體無明顯毒、副作用。 6.與體外實驗結果相似,熊果酸能下調舌癌裸鼠移植瘤NF-κB、VEGF、Bc1-2 mRNA以及蛋白表達,上調Bax mRNA及蛋白表達。誘導細胞凋亡,抑制移植瘤生長。本研究為熊果酸的臨床應用提供一定的參考資料。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.8
【圖文】：

中芄鉿岫勻松喟?Tcas113細胞增殖的影響及促凋亡作用用時間延長、濃度升高，抑制程度增加(見表1一1，圖1一1)。其中25四o1/L濃度組已具有較強抑制作用，48小時將近達到半數(shù)抑制率。因此，本研究其他相關實驗均選用 25omol/L濃度的熊果酸用作實驗。3.流式細胞儀分析細胞凋亡率及細胞周期變化流式細胞雙標檢測顯示，熊果酸作用0h(對照組)、24、48、72h可見凋亡逐漸增加。其凋亡比例(見表1一2，圖1一2一1一3)，隨藥物作用時間延長，出現(xiàn)少數(shù)壞死細胞。電鏡下可見熊果酸作用后腫瘤細胞核碎裂，細胞質充滿了空泡。流式細胞檢查細胞周期顯示，25omol/L熊果酸作用0h(對照組)、24、48、72h可見

治療結束時，兩組裸鼠瘤質量有顯著性差異(t=23.327汗代0.01)。體積抑瘤率和質量抑瘤率分別達61.72%和55.65%(Z人(0.01)。表明熊果酸能有效抑制舌癌移植瘤的生長(見表3一1一3一2;圖3一1，3一2;照片3一1)。熊果酸毒性評價:整個治療過程中，裸鼠精神狀態(tài)可，生長發(fā)育、飲食、活動均未見明顯異常，表明熊果酸毒性反應小。治療結束時兩組裸鼠體重未見明顯差異(見表3一3)。

llllllllllllllllllllll尸尸.~一-，....1--匕匕圖3一1不同治療時間腫瘤體積比較Fig3一 1ComparisonoftumorvolumatvarianttimePointsaftertreatment表3一2治療前后各組裸鼠體質量變化(Table3一 2Bodymassehangesofthenudemieein beforeandafterthetreatment萬士s，n=6) twogrouPsbetween組別治療前體質褚_(g)治療后體質址(g)對照組19.7;1土 1.262567士1.12實驗織19.58士1.2飛25.87土1

【參考文獻】

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本文編號：2793720